谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成 是研究得最为广泛的。图 2 列出了 谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物 合成相关的途径及重要步骤的代谢 调节情况。
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基质
其中，各相关酶及 途径水平上的代谢调节， 以及整个细胞水平上的 全局调节对于代谢流的 导向和改造是至关重要 的。对微生物整个代谢 网络进行有目的的改造 和设计涉及到大范围的 遗传改造。
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正确描述代谢网络的主要节点的 调控模式是十分必要的，但常常是十 分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和 磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就 是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、 PYR和OAA所构成的 “ 奇异三角区 ” （magic triangle）是研究的热点 。
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该途径上另一值得关注的 特征是从六氢吡啶二羧酸出发 合成二氨基庚二酸的旁路途径 的出现，借助于 NMR 手段已 经得知，旁路的出现依赖于某 些代谢条件，特别是可利用的 NH4+的存在。
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另一个重要的方面是参与特定 氨基酸合成途径及与之相关的其他 代谢途径的酶的调节特性，包括酶 活力的调节和酶的表达的调节。特 别是必须详细研究中间产物或终端 产物对途径起点或分支处的关键酶 的调节。
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奇异三角区
Glc
注： ①PK, ②PC,
PEP
Glc
③PEPC, ④PEPCK,
③
④ ②
⑥ ① ⑦ G6P
⑤OAADC,
⑥PEPS, ⑦PTS
PYR
⑤
AcCoA
OAA
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PEP通过PYR和AcCoA向TCA 环提供C2单位，同时，PEP、PYR 以及 AcCoA 还通过回补反应（ 通 过乙醛酸环）为TCA环提供重要中 间产物，这些回补反应对于以TCA 环代谢中间产物 为前体的氨基酸的 生产来说是非常必要的。
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氨基酸的生产中经常用到特定 的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面， 在分成两支的氨基酸合成途径中， 一个分支途径的终端产物氨基酸的 营养缺陷，通常对另一分支的终端 产物氨基酸的合成起促进作用。
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用遗传学与生理学相结合的方法
研究氨基酸生产
前
言
对微生物的代谢途径及代谢网络进行 有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然 是现代生物工程学的一个主攻目标。为了 攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完 善的细胞生理学、生物化学、分子生物学 及生物过程工程等学科的基本状况做一番 描述，主要有如下几个话题:
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2013-7-31 张星元：发酵原理（讲号： ASA为天门冬氨酸-β-半醛， Hse 为 高 丝 氨 酸 ， SucAKPA 为 琥 珀 酰 二 氨 基庚二酸；AK为天冬氨 酸 激 酶 ， DHDPS 为 二 氢 吡 啶 二 羧 酸 合 酶 ， HDH 为高丝氨酸脱氢酶，HK 为高丝氨酸激酶，TDH为 苏氨酸脱氢酶，AHAS为 乙酰羟酸合酶； PEPS为 PEP 合 成 酶 ， PK 为 丙 酮 酸 激 酶 ， PC为 丙 酮 酸 羧 化酶，OAADC为草酰乙 酸 脱 羧 酶 ， PEPC 为 PEP 羧 化 酶 ， PEPCK 为 PEP 羧激酶。
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除了以上这些反映代谢途径基本 信息的资料外，代谢流量的相对固定 的分布以及代谢流量的动力学响应同 样是至关重要的。这既涉及到中心代 谢途径（提供碳架物质、还原力及代 谢能）的代谢流的定量分析，又涉及 到特定氨基酸专用的合成途径的代谢 流的定量分析。
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目的产物的合成途径是理解氨基酸 生产的前提和核心内容 。相关的代谢途 径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸 的合成的专用途径，也包括提供前体碳 架物的途径、从专用途径分流最终导致 副产物生成的分支途径、相应氨基酸自 身被降解的途径、以及那些提供还原力 和代谢能量的途径。
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合成代谢途径通常受反馈抑制和 反馈阻遏的严格调控，比如 图2 中的 AK、HDH、TDH、AHAS等。 不过， 相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌 中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途 径的调节还是比较简单的。
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传统的设计育种（ 随机诱变加定 向筛选），以及DNA重组技术在设计 育种中的应用已经大大提高了 微生物 对氨基酸的生产能力， 但人们对于氨 基酸产生菌的生理学与生物化学等 主 要领域的基础知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面理解氨基酸 的代谢基础：
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①具有生物工程学重要性的微生物的 基本代谢途径及其对应的酶的性质； ②酶及其调节方式，途径及其调节方 式； ③中心代谢途径及离心途径代谢流量 的定量分析； ④对跨膜传送（基质吸收和产物分泌） 的详尽的了解。
图1. 微生物细胞合成氨基酸的 相关途径及代谢调节示意图
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跨膜吸收
基质
全 局 调 节 系 统
异化途径
碳架、还原力、代谢能
同化途径
副产物
反馈 调节
氨基酸
降解途径
跨膜输出
氨基酸
重吸收
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该同化（合成）途径通过草酰乙酸 （OAA）与中心代谢途径相接，天冬氨 酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回 补途径及TCA 环的草酰乙酸， 进入合 成途径并在天冬氨酸 -β- 半醛（ ASA） 处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另 一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸 ） 及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天 冬氨酸激酶（ AK ），其他重要的酶包 括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸 脱氢酶（TDH）。
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1. 氨基酸生产的代谢基础 2. 氨基酸生物合成的代谢流量 分析 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出 4. 氨基酸生产的代谢设计
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1. 氨基酸生产的代谢基础
1.1 氨基酸的生物合成 1.2 代谢产物生产的生理学
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该区包含可能有多达七个酶的参与， 其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、 丙酮酸激酶 （ PK ）、 草酰乙酸脱羧 酶 （OAADC ）和磷酸烯醇式丙酮酸磷 酸转移酶系统（PTS）都已得到鉴定，磷 酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ）已被 假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ）的存在 已得到代谢流量分析的实验数据的支持。
①与生物工程相关的氨基酸产生 菌的相关途径的研究进展情况， 其中必须包括这些途径的代谢调 节以及细胞的整个调节网络的研 究进展情况。
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②对所有的相关途径进行详细的代谢流 量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架 物流量，流经向心途径、中心代谢途径 和离心途径的碳架物流量，以及代谢中 间产物流出细胞的碳架物流量 （ the central and peripheral carbon fluxes）。 还原力的流量 （ redox flux ）及能量流 量（energy flux）。
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G6P
奇异三角区
PEP
PTS PEPS
PK PEPC AcCoA OAADC PEPCK PC
PYR
Asp
Thr I Lys I
OAA TCA
CTA
AK lysC
Asp-P ASA
DHDPS dapA HDH hom Thr I Met R
Hse
HK Met R thrB
Met
DDP Thr
TDH ilvA SucAKPA DAP Ile I AHAS Ile I ilv BN Ile，Leu,Val R
Lys
Ile
图2. 天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节. (其中 I 表示反馈抑制；R 表示反馈阻遏)
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要想根据细胞粗提取液的测定 结果对这些酶的调控性质做出适当 的解释是靠不住的。这一方面是因 为它们在这些条件下可能不稳定； 另一方面，对于需要什么样的辅因 子才能保持它们的活性或（和）它 们在缓冲液中的稳定性，也知之甚 少；而且特别是因为在抽提的过程 中，那些参与胞内酶活性调节的必 需因子会丢失。
此外，基质吸收和目的产物输出等 有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产 也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般 工业微生物基质吸收方面的知识是相当 欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近 年才受到关注。方向性的跨膜反应的机 理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等 方面的知识对于理解氨基酸生产过程也 是相当重要的。
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谷氨酸棒杆菌中存在 α- 酮戊二 酸脱氢酶便是一例。人们最初认为 这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。 正因为如此，才出现了这样的假设， 即：TCA 环在该处的中断引起 α酮戊二酸的 “ 溢出 ”， 最终导致 谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶 在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的， 但是它似乎很不稳定。
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再往后的流量控制点是是通往赖 氨酸 DDP合酶（见图中DHDPS） 以 及赖氨酸的需能输出。要获得令人满 意的结果，必须全面考虑这些方面， 仅仅对于个别反应（即便是最重要的 调控点）进行改造并不是理想的方法， Broer 等曾将脱敏的 AK 的基因导入 野生菌中进行表达，但并未获得很令 人满意的赖氨酸产量。