第二节 生物大分子相互作用分析技术
1. 研究思路 2. 分类 3. 技术介绍
生物大分子相互作用分析研究思路
鉴定与目标分子相互作用 的所有可能大分子
详细描述其生物功能及相互 作用对其功能的影响
鉴定出相互作用且在生理状态下得 到了验证和合理的解释
生物大分子相互作用分析技术
❖ GST 融合蛋白技术(GST pull-down) ❖ 免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP ) ❖ 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP) ❖ 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid) ❖ 噬菌体展示(Phage display) ❖ 细胞内蛋白质共定位(Co-localization) ❖ 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET) ❖ 表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR) ❖ ……
S
C
SDS-PAGE gel
Controls
R Add prey
R Wash
R Elution
Analysis
实验流程
GST融合蛋白
+
谷胱甘肽-琼脂糖微珠
X GST
Y 细胞裂解物
4℃下孵育2h tube
X GST Y
GST pull-down 应用
鉴定未知相互作用的蛋白 鉴定预测的或已知的相互作用
引言
原核生物细胞结构
质膜 肽聚糖
被膜
引言 植物细胞
真核生物细胞结构
动物细胞
细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核
引言
The approximate composition of a bacterial cell.
细胞中的大分子 Macromolecules in Cells
第一节 生物大分子相互作用分析的意义
蛋白质信息的不同层次
蛋白质结构和序列特点 蛋白质进化过程和保守序列 蛋白质表达谱 蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构 蛋白质翻译后修饰情况 了解与其相关联的其他细胞蛋白质
生物大分子复合物的类型
❖ 蛋白质同源二聚体(homodimer) ❖ 蛋白质异源二聚体(heterodimer) ❖ 蛋白质多聚体(polymer) ❖ 蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex) ❖ 蛋白质-脂质复合物(protein-lipid complex) ❖ 蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex) ❖ DNA-DNA复合物(DNA-DNA complex) ❖ ……
举例
GST pull down验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用
Y-GST GST
input
X-GST GST
input
Y-GFP + + + 105kD
Anti-GFP
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transfera
GST pull-down assay Purification of protein
GST fusion protein Glutathione column
Glutathione bead
Tags Pull-Down 方法的组成
1.GST融合蛋白技术 （GST pull-down assay） ——基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统
基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和 固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋 白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目 的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用 的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通 过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白 间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵 蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、 纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系 统等方法获得。
4 生物大分子相互作用分析技术(基础医 学与医学实验技术)
主要内容
第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）
引言
细胞结构 cell
真核生物细胞 eukaryotic cell 原核生物细胞 prokaryotic cell
mRNA
mRNA degradation control
translation control
protein
active protein
Post-translation control
cytoplasm
生命机制
Protein complex
Signaling net work
蛋白质组学的分类
表达蛋白质组学 Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable
DNA sequence
分子水平 ?
Proteins Structure Function
All Cell
基因表达的调控层次
DNA
Primary transcript
mRNA
Transcriptional Post-transcriptional
control
control
nucleus
Inactive mRNA
Re（GST, His, Flag, HA, MBP）
R tag
bait
prey
实验设计思路
Pull-down experiment
R R R R
Wash Add prey Wash Elution
Analysis
Bait Prey
结构基因组学 Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes
功能蛋白质组学 To study protein-protein interaction, 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.