实验5 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
一. 目的要求
(1) 了解高效液相色谱仪构造。

(2) 了解高效液相色谱分析操作。

(3) 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法
二. 基本原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。

由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。

这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。

本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析相同：
1
%100n i i i i
A c A ==⨯∑ 对羟基苯甲酸酸类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上式可简化为：
1
%100n i i i i i i
f A c f A ==⨯∑
三. 仪器与试剂
仪器： LC-4A 型高效液相色谱仪；紫外光度检测器；记录仪；微量进样器 10 μL ；超声波发生器。

试剂： 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等，均为分析纯；甲醇，分析纯；二次蒸馏水。

洗脱剂须经二次蒸馏并经微滤膜过滤。

标准溶液的配制：
(1)标准贮备液：分别于四只100 mL 容量瓶中，配制浓度均为1000 μg ·mL -1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。

(2)标准使用液：用上述四种标准贮备液分别于四只10 mL 容量瓶中，配制浓度均为10 μg ·mL -1 的四种酯类化合物的甲醇溶液，混匀备用。

四. 实验条件
1．色谱往长25 cm、内径3 mm，装填C-18烷基键合相,颗粒度为10 μm的固定相。

2．流动相甲醇:水(70:30)，流量1 mL·min-1。

3．检测器紫外光度检测器，254 nm。

4．记录仪量程5 mV，走纸速度480 mm/h。

5．进样量 3 μL。

五实验步骤
1．将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气15 min。

2．根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤，调节至进样状态，待仪器达到平衡时，记录仪基线呈直线，即可进样。

3．依次分别吸取3 μL的四种标淮使用液和未知试液进样，记录各色谱图。

六. 数据及处理
1．记录实验条件
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱峰的保留时间t r，并填于下表中。

3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A 及其含量%c i，并将数据列于下表中。

七. 思考题
1．高效浓相色谱分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子?
2．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。

3．高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？。