细胞培养及检测相关技术小结一、细胞培养基配制以1000ml培养基为例。

1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%)(1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml(2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml(3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water(4). FBS (15%,v/v) 150 ml(5). Filter to sterilized bottle(6). Label the bottle and store in 4℃.Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. 二、PBS（10×）NaCl: 80g/LKCl: 2g/LNa2HPO4: 14.4 g/LKH2PO4: 2.4 g/LPH=7.4, with HCl or NaOHToo much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need.三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×)This solution is used for cell released from the culture flask。

The final concentration of EDTA is 0.05%;The final concentration of Trypsin is 0.53 mmol/L.Take 40 ml solution for example (10×)(1). Trypsin: 40ml×0.05%×10 =0.02g(2). EDTA: 40ml×0.53×10-3×376(molecular weight)×10-3×10 =0.0797g(3). PBS 40 ml(4). Filter and distribute it into 2 ml sterilized tubes.四、细胞冻存液细胞冻存液是DMSO（二甲基亚砜）和FBS的混合液，DMSO与FBS的体积比为1：2，混合均匀后过滤，加0.5ml混合液入灭菌过的冻存管，放进-20℃冰箱中备用。

五、传代细胞买来时，多为老细胞，细胞活性不强，因此，需要先传代以恢复其活性。

细胞刚买来时，培养瓶里面一般都装满了培养基，在操作时，需要先将培养基移出至干净灭菌的管子备用。

1.取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体量），进行消化：a)吸取19ml PBS（需用小滤膜过滤去除细菌等）b)弃去旧培养基c)用5ml PBS 晃洗培养瓶，弃去PBS，并重复一次。

d)在剩余的9ml PBS中加入1ml的trypsin+EDTA 消化液（消化液为10倍于正常浓度）。

过滤后加入培养瓶中。

如果细胞贴壁不牢，只需要加一次，2ml；如果细胞贴壁牢固，第一次可加入3~5ml，水平晃动几秒后弃去，再加入2ml消化液，晃动并轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下来时，加入10ml细胞培养液，并将细胞液移至离心管。

2.离心，1200rev/min，5min。

弃去上清液，晃动离心管使细胞分散，加入培养基10ml，用两个培养瓶分装细胞液；3.标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。

Notes： 1. 细胞不能长时间处于无液体状态，因此在每个步骤之间，应该作好准备工作，如在步骤1.c)和1.d)之间，应该先准备消化液，再弃去第二次的PBS清洗液。

2. 通常情况下，成骨细胞的贴壁力较强，因此可以弃去第一次的消化液，再加入第二次；反之，如遇到贴壁力较弱细胞，加入一次消化液肉眼可见细胞明显脱落，则只需加入这一次消化液。

3. 在显微镜下观察细胞脱壁情况时，细胞呈圆形并聚集成团，水平晃动培养瓶时，细胞跟随瓶子晃动，在此，要确认细胞完全从瓶壁上消化下来。

4. 在分散离心后的细胞时，要确认细胞分散均匀，因为成团的细胞不利于细胞生长，并且对LDH等实验结果影响较大。

六、换液传代后，细胞生长每两天就需要换一次液，以补充细胞生长所需的养分。

换液前，需在显微镜下观察细胞的生长状态，要特别注意细胞是否被污染，如果是被污染，应弃去污染的细胞。

换液时，弃去旧培养基，加入新鲜培养基，每瓶5ml。

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3Day 4 Day 5 Day 6 Day 7七、冻存细胞（缓冻）1. 灭菌细胞冷冻管，灭菌前，半旋开管盖，灭菌完毕以后，旋紧；2. 取出已准备好的细胞冻存液（见四）；3. 按照传代的操作（见五）将细胞脱壁，分散后加入适量培养基，然后计数细胞，冻存细胞时细胞的最佳密度为1e6 cells/ml；4. 1ml细胞液进细胞冻存管（已有0.5ml细胞冻存液，混合均匀）；5. 适量异丙醇C3H7OH进冷冻盒；（丙醇为一种冷冻介质，使冷冻速度为1℃/min）6. 把冷冻管放进冷冻盒，放进-70℃的冰箱；7. 一周后（一般大于24h即可），取出冷冻盒，把冷冻管放进液氮中-170℃冻存。

Notes: DMSO is harmful to cells at room temperature, but can protect cells at very low temperature.八、细胞复苏（速溶）1. 液氮中取出冷冻管，迅速放入小烧杯中，注意小烧杯中的水应该低于冷冻管口避免污染，待细胞液融化后，用酒精擦拭管口，然后打开管盖将细胞液移至已灭菌烧杯；之后缓慢地加入10ml培养基，在10min内完成，（缓慢地让细胞内的DMSO释放出来）。

2. 分装细胞液，5ml/瓶，第二天换液去掉冻存液中的DMSO。

九、骨髓细胞原代培养（综合上述各步骤）：1.购买约大鼠3只；灭菌实验用的器具。

2.用乙醚麻醉后，敲碎头盖骨，并剪断颈椎，致死。

3.剪开腿部皮肤及肌肉，取出上肢骨和下肢骨（要从关节处剪开，此时不应暴露骨髓腔），用PBS浸泡。

4.用手术刀、剪、切断骨的两端，可见骨髓腔，并用已过滤（0.22um滤膜）的培养基，冲洗骨髓腔，收集冲洗液（含骨髓细胞）。

5.1000rpm的速度离心冲洗液。

6.弃去离心管中上清液，加入新培养基，并加入抗生素（青霉素和链霉素各200u/ml，此浓度为正常浓度的两倍，主要是考虑到操作过程有染菌的可能）。

7.分装至培养瓶中，每瓶5ml含骨髓细胞培养基，置于培养箱中培养。

8.培养三天后，更换培养基，依旧加入200u/ml 的青霉素和链霉素，继续培养箱培养。

9.培养两天后，更换培养基，依旧加入200u/ml 的青霉素和链霉素，继续培养箱培养。

10.培养两天后，更换培养基，依旧加入200u/ml 的青霉素和链霉素，继续培养箱培养。

（原代培养的前一星期需加抗生素抑菌，后面培养中则不需加抗生素）11.培养两天后，更换培养基，不加抗生素，继续培养箱培养，隔两天换液。

（一般在星期一、三、五进行换液）12.约培养两星期后，可见小鼠骨髓细胞生长良好，已长满25cm2培养瓶的底面，此时可以冻存部分细胞，以备下次实验使用，冻存过程如下：a)用2倍于常用浓度的trypsin+EDTA 进行消化。

b)消化后，加入适量培养基（至少与消化液等量的培养基，以保护离心过程中消化液对细胞没有过大伤害），1500rpm下离心5min。

c)弃上清后，振荡分散均匀，然后加入培养基稀释成4ml的细胞液，细胞计数。

d)冷冻小瓶中预先加入0.5ml的冻存保护液，然后再加入1ml的细胞液（保护液为FBS：DMSO＝2：1，则培养瓶中液体的配比为→培养基：FBS：DMSO＝6：3：1），写上细胞名称，传代数，细胞浓度，操作人，时间。

冻存浓度：>1e6cells/mle)将冷冻小瓶放入冷冻盒内，盒内预先加入正丙醇或异丙醇（使温度变化缓慢，保护细胞），置于-70℃低温冰箱中冻存一星期后，转移到液氮内冻存即可。

13.冻存细胞的复苏：a)取出冻存小瓶，常温解冻后，向溶解的细胞液中加入8ml培养基，此培养基慢加，一般在10分钟左右加完。

b)分装至培养瓶或培养皿中。

十、MG63细胞株培养细胞株可以无限快速增殖，平常只需正常换细胞培养基（两天一次），传代（细胞长满培养瓶底部即可，一般为一周一次）。

检测方法：Cytotoxicity检测细胞毒性▪LDHProliferation and viability of the cell检测细胞增殖和细胞活力: ▪MTT, Alamar BlueFunctional secretion of the cell细胞功能代谢：▪ALP（碱性磷酸酶为细胞分化早期标志物）Immunofluorescence stain：细胞骨架和其它特异蛋白。

Morphology of the cell on material surface形貌观察：▪SEM,phase contrast microscopyLDH（一般不选此方法）LDH是一种检测细胞损伤程度的方法，所以一般不采用本方法检测成骨细胞在材料表面的增殖分化，只用于检测某材料对细胞的毒性有多大。

在材料表面种下细胞，细胞会在材料表面贴壁生长，如果材料的生物功能性不好或有细胞毒性，就会损坏细胞。

LDH是乳酸脱氢酶，只存在于细胞膜内，因此细胞膜损坏后，LDH 会释放在上清液中。

加入LDH Reagent后，溶液显色，呈淡兰色，这是一个酶动力学反应过程。

颜色越深表示LDH的量越多，因此细胞损伤越严重。

它是一种检测材料和细胞刚刚接触的一个反应，所以应在细胞种上之后马上作此实验。

对于药物而言，这个实验并不是必须，因为药物对细胞不会马上有毒性，所以一般对药物不做LDH.Lacatate + NAD+LDH Pyruvate + NADH + H+1、灭菌样品、镊子及所需实验器具；2、配制无血清的培养基(1 ml/well)M199: 9.5 g/LNaHCO3: 2.2 g/LTwice distilled water过滤备用；3、取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体量），进行消化：a)吸取19ml PBS（需用小滤膜过滤去除细菌等）b)弃去旧培养基c)用5ml PBS 晃洗培养瓶，弃去PBS，并重复一次。