1. 核酸外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ,ExoⅢ)的消化
原理：就是利用核酸外切酶 Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ可特异性地切割线 型双链DNA分子3’凹端产生5’突出端这一性 质而进行的一种缺失反应。利用该技术可构 建一系列梯度缺失重组子
A B C
2．BAL 31 的消化
主要活性：3’外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3’ 端去除单核苷酸。
突变方式: 定点诱变 随机诱变
•易错PCR(error-prone PCR) •DNA重排(DNA shuffling) •体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) •交错延伸(staggered extension process,StEP)
还具有较弱的内切核酸酶活性可降解单链（单 链， nick, gap），依赖 Ca2+ ，EGTA 可抑制活 性子
利用BAL 31核酸酶制备嵌套缺失突变体
处理不同时间
Klenow DNA聚合酶 补平末端
与克隆载体连接
3．DNase Ⅰ 的消化
一种内切酶，可优先水解 ds or ss DNA 中的 嘧啶核苷酸 。
6.纯化质粒，转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素 筛选
7.必要的话，影印一份平板，鉴定四环素敏感的克 隆子，从而获得突变体
8.再做一轮诱变，修复四环素抗性基因并敲除氨苄 青霉素抗性基因
位点选择诱变原理图
（三）转化子诱变 Transformer Site-Directed mutagenesis
使用了2个寡核苷酸引物
➢一个是用来引入突变的突变引物
➢一个是用来剔除单一酶切位点的
将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上 必须存在单一酶切位点。当这两个引物同时指导 DNA合成时，突变的DNA链将不再含有单一酶切 位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大 肠杆菌，线性化的DNA不能复制，只有突变链保持 环状，可以获得转化子
一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程
三个步骤：
1. 突变寡核苷酸引物的合成：化学合成能与野 生型DNA模板的靶区域退火、并携带所需突 变的寡核苷酸，作为体外合成DNA的引物
2. 由DNA聚合酶根据模板序列延伸寡核苷酸， 产生含有预定突变的双链DNA
模板：ssDNA or dsDNA。DNA片段，诱变合 成后克隆到载体上；完整的质粒（＜9kb）
设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补。
下图为将某基因的启动子与另一基因的编码序列连接示 意图
基因A 基因B
基因B:引物的5’端部分为基因A的ATG密码 子上游紧邻的序列,3’端则为基因B从ATG 密码子开始的序列
基因A:基因B的融合引物与基因A的融合引 物完全互补
这两个融合引物各自与侧翼引物扩增的产 物有完全同源的序列,可以进行重叠延伸
③ M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。
④ 与引入诱变的 Oligo 复性。
⑤ 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下， 以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链， 形成杂合双链。
⑥ 感染 dut+ ung+ E.coli MV1190 后，在 细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才 能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的 子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而 失去作为模板的能力。
包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、 下游通用引物。
整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。
第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的 上下游DNA片段,这2个DNA片段的末端互补。第1 轮PCR的产物需要经凝胶电泳纯化。
第2轮PCR将上述2个PCR产物混合,通过末端互补 配对互为引物延伸得到完整的含突变位点的全长 DNA
Mg2+ ：独立作用于每条 DNA 链，位点随机。
Mn2+ ：大致在同一位置切割 dsDNA ，产生平 端 或 1-2 个核苷酸突出
控制作用时间,可获得在DNA分子上平均切割 一个位点的DNA片段群.
7. 必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点， 或消除靠近诱变点的已有酶切位点，便于诱变后通 过限制酶消化筛选侯选突变子
三、经典DNA定点诱变
70年代初 φ×174 DNA （ss DNA 5386bp），当用带琥珀突变的 ssDNA 与 变性的野生型DNA片段一起转染细菌时， 观察到“标记获救”现象。即产生带野生 型基因组的噬菌体，原因是野生型 DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配 的异源双链体，后者可被宿主编码的错配 修复系统转变为全长的野生型基因组。由 此可利用突变的 DNA 片段将突变引入到 野生型 DNA 中。
(一)、Kunkel法或称 “U” 法
1．背景介绍 dut-：dUTP 酶缺陷，细胞不能把 dUTP 转 化为 dUMP ，因此细胞内 dUTP 的含量大 为增加，其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正 常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。
ung-：UDG 酶缺陷， UDG 酶[尿嘧啶 （uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）]可除 去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基,产生脱碱基 的位点。含有脱碱基的DNA链不再具备作 为完整复制模板的能力
3. 测序。对突变体DNA进行测序，验证靶点的 突变，确保其它区域没有发生额外的突变
二、诱变寡核苷酸引物的设计
设计原则：
1. 与靶DNA的适当链互补，与靶的其它区域不能错 误杂交
2. 足够的长度与靶序列特异结合，1-2个碱基改变的 引物要求至少25bp长
3. 错配碱基位于中央位置，使每侧有10-15bp与模板 链完全配对。有效引入多于3个核苷酸突变时，要 求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补
2）. 诱变的效率
提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面 临的问题。
通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的 巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生 物素分离突变DNA等手段可以提高诱变效率。
PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分 子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的 基础研究和基因工程中定点改造目的基因更 加简便、高效、低耗。
第四节 嵌套缺失
嵌套缺失(Nested Deletions)的制备主要依赖核 酸酶,如核酸外切酶Ⅲ (ExonucleaseⅢ,ExoⅢ),BAL31或DNaseⅠ,这些 酶可以特定的作用方式消化DNA,同时消化 DNA的速率可控制,因此能同时分离嵌套缺失 和多组终末端相差无几的缺失体
利用该技术可构建一系列梯度缺失重组子,借此 可对该段DNA分子上的重要功能区进行定位, 用于寻找在基因表达调控中起关键作用的启动 子和增强子等顺式作用元件
突变类型: 单个碱基的置换 简单的插入或缺失 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第三节 寡核苷酸介导的定点诱变 p176
基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）: 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱 基发生取代、插入或缺失突变的过程
需一个或多个含突变碱基的诱变寡核苷酸作为 引物进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合 成的DNA子链的一部分
Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分别建立了单管 大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。单管大引 物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管 中先后进行两轮PCR反应。Song-Hua Ke提出的方案 更加巧妙简单。
需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用 低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温 度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧 翼引物(F2)在较高的退火温度下进行第2轮的反应, 扩增出全长的含突变位点的DNA产物。
基因A P2
P1
基因B
5. 大引物PCR诱变法
大引物PCR法由Kammann M等人于1989
年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加 以改进。
该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物, 经过2轮PCR获得突变的全长DNA。
第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增 产物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼 引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。
4. 5’端与模板完全互补，从上游引物起始的DNA合成 不会取代诱变寡核苷酸,DNA聚合酶的5’→3’外切核 酸酶活性是造成上游DNA合成取代5’核苷酸的原因
5.诱变寡核苷酸引物3’区域有10-15bp与模板链完全配 对，形成足够稳定的杂交分子，有效地从诱变寡核 苷酸引物3’端引发DNA的合成
6.无回文、 重复或自身互补序列，否则，形成二级结 构，与靶序列杂交率降低，导致得不到突变体
制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠 杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的 DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如 M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶
2．原理 Kunkel 法过程包括：
① 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。
② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）
第七章 DNA定点诱变
Site-directed mutagenesis of cloned DNA
突变是研究基因结构与功能的最基本的手段
经典的方法：分离自发突变体
用物理、化学诱变剂处理活体
诱变-整个生物体-目的基因上的突变极其有限
体外诱变(in vitro mutagenesis)：对克隆化的 DNA进行诱变处理可得到经典诱变所能得到 的所有种类的突变
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System