实验五 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖得含量
一:目得
了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖得原理 掌握总糖定量测定得操作方法 二:原理
还原糖就是指含自由醛基或酮基得单糖(如葡萄糖)与某些具有还原性得双糖(如麦芽糖)。

它们在碱性条件下,可变成非常活泼得烯二醇。

遇氧化剂时,具有还原能力,烯二醇本身则被氧化成糖酸及其她产物。

黄色得3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂与还原糖在碱性条件下共热后,自身被还原为棕红色得3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内,反应液里棕红色得深浅与还原糖得含量成正比,在波长为540nm 处测定溶液得吸光度,查对标准曲线并计算,便可求得样品中还原糖得含量。

对于非还原性得双糖(如蔗糖)以及还原性很小得多糖(如淀粉),应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。

再借助于测定还原糖得方法,可推算出总糖得含量。

由于多糖水解时,在每个单糖残基上加了一分子水,因而在计算时,须扣除加入得水量,当样品里多糖含量远大于单糖含量时,则比色测定所得总糖含量应乘以折算
COOH
OH
NO 2O 2N 还原糖
COOH
OH
O 2N NH 2
3,5-二硝基水杨酸
（黄色）
3-氨基-5-硝基水杨酸
（棕红色）
C C H O OH OH C H C H 2OH OH
( )n ( )n C H C OH OH
C H H 2OH OH
糖酸
系数(1-= 0、9),即得比较接近实际得样品中总糖含量。

三:实验材料及设备
1、材料:面粉
2、仪器:分光光度计电子天平沸水浴
3、器材:
刻度试管: 25mL×8
容量瓶: 100mL×2
锥形瓶: 100mL×1
移液管: 1mL×2 2mL×2 10mL×2
烧杯: 250mL×1 50mL×1
滴管: 2
洗耳球: 2
滤纸: 11cm
坐标纸
漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒:各1
四:试剂得配制
1、葡萄糖标准液(1mg/mL)
预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取500mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至500mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。

若该溶液发生混浊与出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。

2、3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)
将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中(不适宜用高温促溶),接着加入500mL含130g酒石酸钾钠得溶液,混匀。

再加入5g结晶酚与5g亚硫酸钠,搅拌溶解后,定容至1000mL。

暗处保存备用。

3、碘液
称取5g碘与10g碘化钾,溶于100mL水中。

4、酚酞指示剂
称取0.1g酚酞,溶于250mL 70%(V/V)得乙醇中。

5、HCl溶液(6N)
取500mL12NHCl,用水稀释至1000mL。

6、NaOH溶液(6N)
取240gNaOH,加水溶解,定容至1000mL。

五:操作步骤
1、样品中总糖得提取
(1) 取材:称取0.7g面粉,准确记录实际质量(W),放入100mL锥形瓶中。

(2) 溶解:先用几滴蒸馏水调成糊状;加入15mL蒸馏水;再加入10mL 6N HCl,
搅匀。

(3) 水解:置于沸水浴中水解30分钟。

用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中,加
1滴碘液,检查淀粉水解程度。

如显蓝色,表明未水解完全,应继续水
解。

如已水解完全,则不显蓝色,可以取出沸水浴中得锥形瓶,冷却。

(4) 中与:加1滴酚酞指示剂,加入10mL 6N NaOH中与至微红色。

(5) 定容:将溶液转移至100mL容量瓶(B
1
)中,定容。

(6) 过滤:用滤纸过滤。

(注意,滤纸不能用蒸馏水湿润。

)
(7) 稀释:精确吸取滤液10mL,移入另一个100mL容量瓶(B
2)中,定容。

(B
2
)液
作为总糖待测液备用。

2、标准曲线制作及样品测定
取8支25mL刻度试管,按下表所示顺序操作。

以0号管为空白参比,测定=540nm处得吸光
度
六:结果处理:
1. 由0～5号管得数据,以葡萄糖含量(mg)为横坐标,A
540
为纵坐标,在坐标纸上绘制标准曲线;
2. 求两个样品管A
540得平均值
—
A
540
;
3. 由—
A
540
从标准曲线中求样品管中葡萄糖得含量(mg);
4. 计算您所取得生物材料中总糖得百分含量。