重组DNA技术包括哪些基本步骤？
• • • • • （1）分离制备目的基因； （2）切割目的基因和载体； （3）目的基因与载体的连接； （4）将重组DNA导入宿主细胞； （5）筛选并鉴定含重组DNA分子的受体细 胞克隆； • （6）克隆基因在受体细胞内进行复制或表 达。
第二章要点
• 限制性核酸内切酶是由细菌产生的一 类识别双链DNA特定序列，并在识别 位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶。 • 限制性核酸内切酶切割DNA后产生5′P和3′-OH的末端
程。
• 转导：以噬菌体或细胞病毒为载体构建的重组DNA
导入原核宿主细胞并获得新的表型的过程。 。
• 转染：是外源ＤＮＡ片段主动或被动 导入真核细胞而获得新的表型的过程。
最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。
常用的核酸提取方法
• 提取基因组DNA的方法： CTAB法 SDS法 • 提取质粒DNA的方法： 碱裂解法 • 提取RNA的方法： 异硫氰酸胍提取法
感受态细胞
• 经过一些特殊方法（如：CaCl2，RbCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外 源DNA的载体分子通过的细胞。
碱裂解法分离质粒 DNA原理
• 在碱性时，所有DNA都变性 • 恢复中性时，染色体DNA不能准确复性， 与其它大分子共沉淀 • 而质粒DNA却可以准确复性，留在上清 中。
碱裂解法三种溶液的主要作用
• 溶液 Ⅰ 的作用是悬浮菌体 • 溶液 Ⅱ 的作用是使 DNA 变性 • 溶液 Ⅲ 的作合适的载体，这 些载体通常包含质粒、噬菌体、粘粒 和YAC
DNA重组
• 指用酶学方法将不同来源的DNA进行 切割、连接，组成一个新的DNA分子 的过程。
• 基因工程中，DNA重组体是指目的基 因与载体的连接物 • 在重组DNA技术中催化形成重组DNA 分子的酶是DNA连接酶
为何常用质粒作为载体
• 质粒是独立于细菌染色体之外，能自 主复制的共价闭合环状双链DNA。 • 经过人工构建的载体，不但能与外源 基因相连接，而且质粒含有复制起始 原点(ori)，，能借助宿主细菌染色体 DNA复制所用的同一套酶系独立地进 行自我复制、克隆。
• 同一种质粒 DNA ，能够以三种不同的 形式存在，分别是ccc DNA、线状 DNA和开环DNA。 • 电泳时，它们的迁移速率依次是： ccc DNA > L DNA> OC DNA
常用的目的基因与载体的连接方法
• （1） 平末端连接：将平末端的DNA 分子在DNA连接酶催化下，使DNA分 子的3′OH和5′P进行共价结合； • （2） 黏性末端连接：衔接体连接法； 人工接头法；同聚物加尾法 • （3）定向克隆法
第四章要点
• 转化：是指以质粒为载体构建的重组DNA导入处于 感受态的原核宿主细胞，并使其获得新的酶催化下合成 ｃＤＮＡ • cDNA 是与 mRNA 互补是用核酸探针的过程也可称为 基因克隆、分子克隆或DNA克隆
常见质粒的结构
• pBR322质粒载体的组成： • 复制起始位点（ori） • Ampr（氨苄青霉素抗性基因）
• Tetr（四环素抗性基因）
pUC系列质粒载体的组成
• 一个复制起始点 • Ampr基因 • 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）
的启动子及其编码α-肽链的DNA序
列，称为LacZ′基因
• （四）转膜（印迹） 常用的膜：NC膜和尼龙膜 • （五）核酸探针（有什么标记） • （六）核酸的固定 • （七）杂交 • （八）洗膜 • （九）杂交信号的检测
• PCR又称聚合酶链式反应，一个循环包括变 性、退火和延伸三个步骤。
• 催化聚合酶链反应需要TaqDNA聚合酶
• PCR是一种酶促反应，一对引物决定了扩增
• 限制性内切核酸酶的命名。
• 载体定义 • 载体的自我复制能力是重组DNA操作 的基础
基因操作中，理想的载体应具备的 基本条件
• • • • • ① 具有独立复制能力； ② 具备多个限制酶的识别位点； ③ 具有遗传表型或筛选标志； ④ 有足够的容量以容纳外源DNA片段； ⑤ 可导入受体细胞。
• 基因工程菌定义 • 基因工程菌的发酵工艺主要有流加式 培养和批式培养
第三章要点
• 变性指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋 解开，双链解链成为单链指不同来源的单链重新配对恢复 成双链
Southern 印迹法步骤
• （一）待测核酸样品的制备 • （二）电泳分离DNA片段 • （三）印迹转移前凝胶的预处理（处 理目的是什么？）
的特异性，扩增对象是DNA序列
• PCR存在错配率
PCR 反应必须组成成员
• • • • • 模板DNA 一对引物 dNTPs Taq列，这些 序列分别pUC18 与 pUC19 的区别在于二者的多克隆 位点方向相反
• 常用的克隆载体有质粒、噬菌体、粘粒和
YAC，其中YAC对外源 DNA 的装载量最大
• 染色体DNA也称基因组DNA，则不能作为
外源基因的载体
常用的目的基因的获取方法目的基因； （4） 人工合成DNA技术。
基因操作技术基础
复习
题型
• • • • • 一、单项选择题（20个，20分） 二、多项选择题（10个，20分） 三、填空题（20个空，20分） 四、名词解释题（5个，10分） 五、简答题（3个，30分）
第一章要点
• 基因是遗传物质的基本单位,也是作为 遗传物质的核酸分子上的一段片段。 • 在分子生物学领域，重组 DNA 又可称 为基因工程 • 基因克隆又称分子克隆，DNA克隆