细胞唾液酸化相关酶的荧光成像检测新方法研究糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它们在各种基础生命活动的过程中起重要作用,并且对机体的恶性转化特别敏感。

绝大部分聚糖的生物合成发生在细胞的内质网和高尔基体中,然而即使在糖蛋白生物合成之后,聚糖结构的修饰依然在酶催化作用下不断的进行着,这一过程称为聚糖重构。

聚糖重构主要受两类酶的催化作用,糖基转移酶和糖苷水解酶,它们的作用分别为生成和降解糖苷键。

由于细胞的糖基化程度通常与疾病,尤其是肿瘤,密切相关,因此糖基转移酶和糖苷水解酶作为潜在的药物靶点和肿瘤诊断标志物引起了研究人员的极大兴趣。

唾液酸化是糖基化中一个备受关注的分支,可以在附着于蛋白质或脂的聚糖链末端位置引入唾液酸(N-乙酰神经氨酸),肿瘤细胞中唾液酸的表达普遍是异常的。

糖缀合物上唾液酸的表达主要受唾液酸转移酶和唾液酸酶的活性的影响。

然而在大多数情况下,肿瘤细胞中唾液酸化异常改变的机理,唾液酸化相关酶的活性与唾液酸化聚糖的表达之间的相互关系仍然未知。

为了阐明唾液酸化相关酶的生物学和病理学功能以及使其作为疾病诊断和治疗的工具,发展检测唾液酸转移酶和唾液酸酶活性的新方法已成为迫切需求。

因此,本工作将化学生物学,细胞学和分子生物学等进行交叉结合,并利用荧光显微技术,纳米材料等,设计发展了新型分析检测方法和纳米探针,对肿瘤细胞中唾液酸转移酶,唾液酸酶的活性分别进行了原位无创检测,为研究聚糖生物合成机理、肿瘤临床诊断和药物开发提供了有力工具。

具体包括以下两个部分工作:1、基于化学选择性识别的活细胞内唾液酸转移酶活性检测唾液酸化的聚糖结构是由唾液酸转移酶(Sialyltransferase,ST)催化合成的,为了阐明唾液酸转移
酶的生物学和病理学功能,对唾液酸转移酶活性进行评估是十分必要的。

然而对细胞内唾液酸转移酶活性的变化进行原位无创检测的方法依然有限,针对这一问题,本工作设计了基于FRET成像的传感平台用于原位检测细胞内唾液酸转移酶的活性并跟踪唾液酸化进程。

四甲基异硫氰酸罗丹明标记的去唾液酸胎球蛋白(TRITC-AF)作为唾液酸转移酶的底物可发生唾液酸化,异硫氰酸荧光素标记的氨基苯硼酸(FITC-APBA)作为化学选择性识别探针可对唾液酸化产物进行特异性识别,两者在脂质体囊泡的作用下被运载到细胞内。

FITC-APBA对唾液酸化TRITC-AF的识别导致FRET信号的产生,通过对FRET 效率进行图像分析可获得唾液酸转移酶活性的相应信息。

利用这一方法,我们对唾液酸转移酶活性与恶性肿瘤、细胞周期、细胞表面唾液酸化以及唾液酸化抑制剂的相互关系进行了研究。

这一方法为研究聚糖生物合成机理、肿瘤临床诊断和药物开发提供了有力工具。

2、中性pH荧光增强型成像用于监测活细胞内溶酶体唾液酸酶活性溶酶体唾液酸酶(Lyso-Neus)是一类位于溶酶体的糖苷水解酶,可以切断糖蛋白或糖脂分子的糖基末端与唾液酸残基相连接的糖苷键,将唾液酸残基水解脱除。

本工作发展了一种中性pH条件下荧光增强型成像策略,利用一种具有唾液酸酶活性响应性并可定位于溶酶体的纳米探针,可对活细胞溶酶体中的唾液酸酶活性进行成像检测。

该纳米探针以静电相互作用和共价结合的方式,分别将分枝状聚乙烯亚胺(BPEI)和唾液酸酶底物4-甲基香豆素基-N-乙酰基-Ca-D-神经氨酸(4MUNA)组装到3-氨基苯硼酸(APBA)修饰的氧化石墨烯(GO)纳米片的表面获得。

该纳米探针通过细胞膜表面的网格蛋白介导的内吞作用进入细胞的溶酶体,
溶酶体中的唾液酸酶特异性的切割纳米探针上无荧光的4MUNA中的糖苷键,使4-甲基香豆素(4MU)从GO纳米片的表面释放。

在BPEI的质子海绵效应作用下,具有pH响应荧光性质的4MU可以从酸性的溶酶体中逃逸到中性的细胞浆中而荧光显著增强,利用4MU产生的荧光,实现了细胞内溶酶体唾液酸酶活性的检测。

本方法还能动态监测细胞内溶酶体唾液酸酶活性在生物过程中的变化,如细胞凋亡早期溶酶体唾液酸酶活性的变化,为研究唾液酸酶的生物学作用提供了一个强有力的工具。