［ 7］ 性 。 其 具 体 操 作 也 可 参 照 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 E 的 测 ［ 活 方 法 lO］ 。 ［ 9］
・ 9 ・
该 方 法 的 优 点 是 ， 可 以 同 时 测 多 个 样 品 ， 而 且 在 可 对 酶 活 性 进 行 测 定 ， 操 作 简 便 、 快 捷 ， 样 品 消 4h 内 耗 小 ， 成 本 低 。 另 外 ， " 的 变 异 系 数 CV% 在 OD655 值 内 ， 可 信 度 高 。 5% 以 应 注 意 的 一 点 是 ， 人 工 血 栓 的 制 作 对 消 光 值 的 测 定 是 有 影 响 的 。 不 过 如 果 反 应 开 始 时 小 孔 内 的 血 栓 的 吸 光 值 在 O . 2 以 上 ， 那 么 人 工 血 栓 的 调 制 对 几 乎 没 有 太 大 的 影 响 。 OD655 值 5
［ 将 其 作 为 预 防 和 治 疗 心 血 管 疾 病 的 药 品 l］ 。 l987 年 ［ 溶 纤 维 活 性 9］ 。 用 溶 解 面 积 来 表 示 NK 的
在 培 养 皿 中 加 入 血 纤 维 蛋 白 原 （ fibrinOgGn） 溶 液 和 凝 血 酶 溶 液 ， 搅 拌 使 其 凝 固 制 成 平 板 。 取 不 同 浓 度 品 点 于 平 板 上 ， 恒 温 孵 育 测 其 溶 解 NK 样 37C l8h， 圈 直 径 。 可 以 发 现 酶 量 与 溶 解 面 积 成 直 线 关 系 。 以 标 准 纤 溶 酶 （ PIasimin） 作 为 标 准 NK 或 UK 或 品 作 标 准 曲 线 。 活 性 单 位 定 义 为 ： 在 37C lmin NK 的 内 分 解 解 于 酸 缓 冲 溶 液 （ pH7 . l nmOI 溶 0 . lmOI / L 磷 中 的 浓 度 4） 5 x l0 - 4 mOI / L 的 H-D-VaI-LGu-Lys-pNA 的 为 或 者 以 UK 或 纤 溶 酶 的 活 性 单 位 来 表 NK 量 lU。 示 。 维 溶 解 面 积 来 表 示 活 性 ， 完 全 是 表 观 值 。 如 恒 温 孵 育 时 间 变 化 ， NK 的 测 定 值 的 变 化 很 大 。 随 着 恒 温 时 间 的 增 加 ， 所 对 应 的 值 显 著 减 少 。 比 之 制 产 品 ， 粗 制 酶 活 性 测 定 NK 精 受 孵 育 时 间 影 响 更 大 ， 这 可 能 是 粗 酶 中 杂 质 的 影 响 。
摘 要 对 先 后 建 立 的 纤 维 平 板 法 等 几 种 测 定 纳 豆 激 酶 活 性 的 方 法 进 行 概 括 总 结 介 绍 。 关 键 词 纳 豆 激 酶 溶 血 栓 活 性 活 性 测 定 纳 豆 是 由 枯 草 杆 菌 （ 或 纳 豆 菌 aciIIus subtiIis） （ 发 酵 大 豆 而 成 ， 在 日 本 的 食 用 历 史 已 BaciIIus nattO） 有 ， 深 受 日 本 人 民 的 喜 爱 。 很 久 以 来 ， 民 间 还 2000 年
纳 豆 激 酶 活 性 测 定 方 法
谢 秋 玲 郭 勇 （ 暨 南 大 学 生 物 工 程 所 广 州 5l0632） 林 剑 （ 华 南 理 工 大 学 食 品 与 生 物 工 程 学 院 广 州 5l064l）
须 见 洋 行 等 首 次 从 纳 豆 中 提 取 了 一 种 具 有 溶 血 栓 作
［ 2］ 用 的 酶 制 剂 ， 命 名 为 纳 豆 激 酶 （ 简 称 NK） 。 来 l0 年
对 于 纳 豆 激 酶 的 特 性 、 药 理 及 生 产 等 方 面 都 有 了 进 一 步 的 研 究
［ 3 ~ 8］
。 而 纳 豆 激 酶 活 性 测 定 方 法 作 为 研
究 的 基 础 ， 也 不 断 地 建 立 并 得 到 改 进 。 现 已 有 的 活 性 测 定 方 法 包 括 以 下 几 种 。 ! 纤 维 蛋 白 平 板 法 纤 维 蛋 白 平 板 法 是 最 早 用 于 NK 活 性 测 定 的 方
［ 12］ 酶 联 免 疫 吸 附 法 （ ELISA）
该 法 是 以 对 NK 有 特 异 性 的 单 克 降 抗 体 与 NK 发 生 特 异 结 合 ， 然 后 再 同 连 有 标 志 酶 的 多 克 隆 抗 体 结 合 ， 形 成 一 种 类 似 三 明 治 的 结 构 ， 通 过 标 志 酶 — — — 即 过 氧 化 物 酶 的 反 应 而 测 定 活 性 。 NK 的 先 将 抗 单 克 隆 抗 体 同 NK 酶 孵 育 ， 之 后 再 NK 的 同 多 克 隆 抗 体 结 合 。 加 入 新 配 制 的 底 物 溶 液 和 2N 测 定 吸 光 值 。 ~2 SO4 ， 49OIm 的 该 法 灵 敏 度 很 好 ， 可 达 到 O . lIg / mI。 同 时 特 异 性 好 ， 同 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 BPN’ 和 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 交 叉 反 应 系 数 分 别 为 O . OOO2% 和 CarIsberg 的 由 此 可 看 出 ， 具 特 异 性 的 单 克 隆 抗 体 同 酶 O.OOOO2% ， 的 结 合 位 点 不 是 催 化 中 心 。 以 经 典 的 平 板 法 所 得 出 的 血 栓 活 性 同 测 得 的 之 间 具 有 NK 溶 ELISA 法 NK 量 线 性 关 系 ， 回 归 方 程 为 （ （ 平 板 法 ） l8 . 98， 相 关 系 数 Y ELISA） = 8 . OOX 为 O . 967 这 说 明 可 以 很 好 地 反 映 NK 的 溶 血 栓 ELISA 法 活 性 。 同 时 同 圆 二 色 性 谱 等 其 他 方 法 的 结 果 ELISA 法 相 结 合 ， 对 NK 的 结 构 探 索 提 供 了 一 定 的 参 考 数 据 ， 从 中 可 以 看 出 ， 温 度 的 提 高 使 NK 活 性 下 降 ， 不 是 因 为 级 结 构 的 破 坏 ， 而 可 能 是 破 坏 了 酶 的 二 级 结 NK 一 构 ， 包 括 旋 和 叠 。 该 法 的 缺 点 是 操 作 复 杂 ， -螺 -折 # $ 成 本 高 。 综 上 所 述 ， 的 测 活 方 法 多 样 ， 各 有 优 缺 点 。 NK 如 今 普 遍 使 用 的 仍 是 经 典 的 平 板 法 和 CLT 法 。 得 到 活 方 法 一 个 更 精 确 、 更 灵 敏 、 更 简 便 、 更 经 济 的 NK 测 是 一 个 有 待 继 续 研 究 的 课 题 。 参 考 文 献
广 东 药 学 2OOO 年 第 第 lO 卷 6 期 因 此 对 恒 温 时 间 的 控 制 是 十 分 重 要 的 。 2 纤 维 蛋 白 块 溶 解 时 间 法 此 法 简 称 。 纤 溶 酶 、 、 溶 血 栓 物 CLT 法 tPA UK 等 质 都 以 此 方 法 来 测 定 活 性 。 测 定 NK 活 性 的 方 法 就 是 根 据 以 上 各 种 方 法 稍 加 变 动 而 建 立 的 。 ， 在 小 试 管 中 依 次 加 入 凝 血 酶 、 硼 酸 生 理 OC 下 盐 水 缓 冲 溶 液 、 溶 液 和 纤 维 蛋 白 原 ， 强 烈 搅 拌 ， 置 NK 于 温 水 浴 。 从 纤 维 蛋 白 形 成 开 始 计 时 ， 随 着 37C 恒 反 应 液 混 浊 ， 有 气 泡 上 升 到 液 面 ， 到 气 泡 冒 出 停 止 时 ， 作 为 纤 维 蛋 白 溶 解 时 间 （ CLT） 。 纤 溶 酶 作 为 标 准 品 ， 以 同 样 以 标 准 NK 或 UK 或 度 的 对 数 作 图 ， 发 现 在 围 内 CLT 对 NK 浓 lO ~ 7O g 范 ! 有 很 好 的 线 性 关 系 。 比 较 于 平 板 法 ， 法 迅 速 快 捷 ， 有 较 大 的 分 辨 CLT 率 ， 且 更 适 于 粗 酶 的 活 性 测 定 。 但 随 着 灵 敏 度 的 提 高 ， 溶 解 时 间 的 判 定 也 更 加 困 难 。 除 非 有 新 型 、 方 便 的 计 时 装 置 ， 否 则 同 时 测 定 多 个 样 品 是 比 较 困 难 的 。 3 四 肽 底 物 法 纳 豆 激 酶 是 一 种 丝 氨 酸 蛋 白 酶 ， 具 有 275 个 氨 基 酸 ， 与 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 （ SubtiIisiI） 同 源 性 极 高 ， 其 中 与 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 BPN’ 和 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 CarIs同 源 性 分 别 为 而 与 枯 草 杆 菌 蛋 berg 的 85% 和 69% ； ［ 4］ 白 酶 有 两 个 氨 基 酸 的 差 异 。 而 且 NK 与 枯 草 E 只 杆 菌 蛋 白 酶 E 的 催 化 中 心 和 结 合 中 心 相 同 ， 因 此 有 方 法 来 测 定 NK 的 活 人 用 测 定 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 E 的
［ 法 之 一 2］ ， 它 是 参 照 尿 激 酶 （ UK） 或 组 织 纤 溶 酶 原 激
活 剂 （ tPA） 的 测 活 方 法 而 建 立 的 。 其 原 理 是 以 凝 血 酶 和 纤 维 蛋 白 原 作 用 制 成 人 工 血 栓 平 板 ， 注 入 NK，