限制性内切酶
Sma I Sau 3A I Not I Sfi I
识别位点
CCC’GGG GGG’CCC GATC’ ’CTAG GC’GGCCGC CGCCGG’CG GGCCNNNN’NGGCC CCGGN’NNNNCCGG

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Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
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基因克隆、 克隆基因的表达
吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室 讲师
孙 巍
Tel: 0431 - 85619369
2012-10
基因克隆趣闻
荧光蛋白基因克隆猫
科学家复活冰冻死老鼠 修正基因蚊子防控疾病
基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛 基因克隆胚芽造就健康婴儿


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Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
1. 具有特定的识别和切割位点 2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端 4. 不同的酶可以产生同样的末端
5.不同的酶可以识别同一个序列
6. 切割会受其他因素的影响
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94℃
55℃
37℃

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Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80 60 40
(%)
20 40 50 100 60 70 80 90

温度(℃)
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94℃
55℃
72℃
限制性内切酶
获诺贝尔化学奖
噬菌体DNA
限制性内切酶
DNA连接酶 重组DNA分子
Paul Berg a biochemistry at Stanford

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克隆：通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同
的子代群体。
molecule DNA clone Cell colony organism
在DNA双链内部的特异位点识别并切割DNA 一个细胞只接受一个 重组DNA分子
单克隆
LOGO基因组DNA（genomic DNA library）： 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克
四、重组DNA转入受体细胞（转）；
五、重组体的筛选与鉴定（筛）。

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一、目的DNA的分离获取（分）
分离获取目的DNA有多种方法：
(一) PCR——待扩增目的基因两端序列法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）

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修正基因蚊子防控疾病
科学家把一种可防疟疾的 基因植入蚊子基因之中,对蚊子 基因进行修正。 在实验中,科学家们不仅仅 在蚊子体内植入了防疟疾基因, 还植入了另一种可以使蚊子眼 睛发出荧光的基因。这样,科学 R反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶

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PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
95℃
第1轮结束 第2轮开始

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PCR的基本原理
互连后？
Bam HⅠ
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA A +GATCT ALOGO TCTAG

GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶
隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。如何从中钓取基因？LOGO
用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链
RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA
样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中 是否有与探针序列同源的目标序列，以及目 标序列的量。
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荧光蛋白基因克隆猫
由韩国科学技术部公布的对比 照片显示出3只具有荧光蛋白 基因的克隆猫（上图为普通光 线照射下，下图为紫外线照射 下）
具有荧光蛋白基因的克隆 猫在紫外线照射下会变色

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科学家复活冰冻死老鼠
一只老鼠死亡后被冷冻了 16年之久,日本科学家从其体内 提取基因克隆了一只新老鼠,这 是人类首次成功克隆冷冻动物 。
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基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛
2007年,英国科学家在实验室 中利用基因转换技术成功地在蝌 蚪头部培育出第三颗眼球。这个 消息对盲人来说是一个天大的喜 讯。利用这种技术,干细胞科学家 们真的有可能实现他们再造眼球 的梦想。

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基因克隆胚芽造就健康婴儿
PCR反应条件 Taq PCR过程 PCR的特点
72℃
Taq
Taq
Taq

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PCR的基本原理
PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点
第2轮结束

体外高效特异性的扩增目的DNA片段

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PCR的基本原理
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口 （blunt end）
黏端切口 （sticky end）LOGO

粘性末端又可分为两种：
1）5-端突出
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
EcoRI

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转膜、
变性、
封闭、
加入变性的探针、
杂交、 洗涤、 检测杂交体。

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如何实现特异性的获得目的基因？

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聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR

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PCR的基本原理
PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2 模板DNA 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
PCR循环

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PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5

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PCR的基本原理
PCR反应条件 50℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2

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PCR的基本原理
Taq酶
能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
Bam HⅠ XmaⅠ
GGATCC CCCGGG CCTAGG GGGCCC
GGATCC CCCGGG CCTAGG GGGCCC
G GATCC C CCGGG CCTAG + G CCCGG + G GATCC G CCC + GGG G + CCC CCTAG GGG
核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。

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Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
1. 具有特定的识别和切割位点 识别位点通常为6或4碱基序列
II型限制性内切酶的识别位点举例（'示切割位点） 限制性内切酶
Apa I BamH I Pst I EcoR I
识别位点
GGGCC’C C’CCGGG G’GATCC CCTAG’G CTGCA’G G’ACGTC G’AATTC CTTAA’G
BstⅠ SmaⅠ
为DNA操作增加了酶的可选余地

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Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
6. 切割会受其他因素的影响

通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。 如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油 浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活 性（star activity），以EcoR I*表示。
5- AATTC……. 3 5………GOH HOG…… 5 3………CTTAA -5
2）3-端突出
5 ………CTGCA G………3 3 …… C ACGTC……… 5
PstI
5 ………CTGCAOH 3 ………G-5 5- G……… 3
HO

基因的秘密随着科技的日益发达而 被逐渐揭开。血友病、色盲、白化 病……这些遗传病困扰着一个又一 个家庭，也激励着一代又一代科学 家为之奋斗。

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分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术
1980年，
1972年，
世界上第一个重组DNA分子诞生
猿猴病毒DNA
2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从5’到3’方向的核苷酸序列完全一致

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Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG

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限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease
可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，分子生物学中通常使用的是Ⅱ型：