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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• （1934年成功进行了单细胞动物核移植操作。） • 1938年（Hans Spemam）：提出“8细胞期以前的
细胞核具发育的全能性”，构想实验：将胚胎细胞 核移入去核的卵内。但因技术原因未完成。 • 1952年（Robert Brrigs 和T.J.King）：豹蛙囊胚细 胞核移入去核卵内，获得可摄食的幼体。1955年， 移入卵母细胞，获得蝌蚪，甚至成体蛙。
• （1）受精卵核融合前，去掉精核，细胞松弛素B处 理；（B：细胞排出细胞核形成胞质体和核质体 ）
• （2）经处理后，卵染色体复制后出现两个核，在 进行培养；
• （3）卵中双核自动融合，并进行分裂； • （4）胚胎移植； • （5）生产出7只单亲小鼠。（只有母本的染色体）
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9.3 哺乳类的细胞核移植
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9.3 哺乳类的细胞核移植 • 其技术的发展和成功，经历的是一个艰难
曲折的过程。 • 哺乳动物卵：体积小，鼠——80μm左右，
兔125，牛140，人100。必须在很精密仪 器——显微操作仪下才能进行核移植。
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9.3 哺乳类的细胞核移植
• 1977年（美国）：“亚无性繁殖”培育出单亲小鼠 ：
• 哺乳动物细胞核移植实验（1981年，瑞士和美国 ）的成功：小鼠囊胚内细胞团细胞核移入去核受 精卵中，培养，胚胎移植，产下2雌1雄仔鼠，并 发育成可育个体。
细胞松弛素B：体外培养细胞能诱发其排核。借助 细胞松弛素B的作用，结合高速离心得到胞质体 。 2.核体 与胞质分离的得到的细胞பைடு நூலகம்，带有少量胞质并围 有质膜，成为核体。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.微细胞 秋水仙素处理。 经体外培养，在单个染色体或染色体周缘会重现 核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个 完整质膜的微细胞。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸纳 等使细胞膜裂解。常辅以机械方法。
4.高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组常用的材料： 1.胞质体
鲤鱼去核未受精卵，实现核质杂交，培育出“鲤鲫 核鱼”（有鲫鱼的鲜美味道和鲤鱼的快速生长）。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 鱼类、两栖类核移植技术的建立，为今天的哺乳动 物体细胞克隆打下良好的基础。
• 但当时许多科学家认为：两栖类本身的某些特殊条 件使其成功，而哺乳类的核移植几乎是不可能的。
第九章 细胞重组与动物克隆
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞重组（cell reconstruction）：体外不同来源的 细胞器及细胞组分重组成具有生物活性的细胞或细 胞器的技术。
• 细胞拆合：分离细胞核与细胞质（或移去核、射线 使核失活）将同种或异种细胞核和细胞质重新组成 新细胞，从而培养新细胞或新生物个体。
• 细胞重组的三种基本方式： • 胞质杂种（cybrid）：胞质体与完整细胞重组； • 微细胞异核体（herterokaryon）：微细胞与完整细
胞重组成微细胞异核体； • 核质杂种细胞：胞质体与核体重组成核质杂种细胞
。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 胞质体（cytoplast）：去核后的无核细胞。通过核 移植技术制备。
• 我国童第周等（1961年开始）：鱼类（金鱼等 ）不 同亚科间细胞核移植，研究核的发育功能、核质关 系。1978年将黑斑蛙成体红细胞核移入未受精卵内 ，发育成正常蝌蚪。（说明高度分化的细胞仍保留 着物种的全部基因）
• 1979年水生所：鲫鱼，获得幼鱼，发育正常。 • 1989年（童第周、牛满江）：鲫鱼胚胎细胞核移入
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，同 时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减 慢细胞发育。借助显微操作仪，用细微玻璃针或 微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中，可 以挑去细胞核，人工造就去核细胞。
这种仪器能进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物 质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位 的变化等等。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
• 1958——1962年（英国剑桥大学）：爪蟾原肠内胚
层细胞核移植，培育出可育的成体。1970年（约翰· 格登）用蛙，获得了蝌蚪。
• 蛙和蟾蜍实验证明：分化细胞的核具全能性；细胞 分化不需遗传物质的不可逆修饰。
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9.2 鱼类两栖类的细胞核移植
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
3.流式细胞仪分离法 以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然 后用超声波处理使其分散成单个细胞。将细胞悬浮液 通过直径为50μm的喷嘴变成极小微粒，每个微粒含有 一个细胞，以10m/s的速度喷出。激光照射，荧光被 激发而转换成脉冲。依脉冲分离细胞。或施加电场使 细胞移行偏斜的程度不同而收集不同的细胞。
优点：分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能； 缺点：需要专门的设备。
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9.1.1 概述细胞重组与动物克隆
• 细胞破碎方法： 1.超声波破碎法
超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传 送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击产生的 剪切刀使细胞破碎。（缺点：热产生） 2.反复冻存法 细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内 冷冻后，在37℃复融化，重复此操作3~4次使细 胞壁破碎。
• 微质体或亚原生质体（miniprotoplast or subprotoplast） ：植物去核的原生质体。
• 微细胞（microcell）：具有一或几条染色体、一薄 层细胞质和完整细胞质膜的核质体。制备：秋水仙 素——产生多个有核膜的微核；细胞松弛素B—— 微核突出到细胞膜外；离心——微细胞（一个微核 和一薄层细胞质以及完整细胞质膜）。