LST初发酵
大肠菌群检验(MPN法)
• 6.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养 物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 管中，36 ℃±1℃培养48h±2 h，观察产 气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
大肠菌群检验(MPN法)
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煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB 胆盐可抑制革兰氏阳性菌。 煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑 制作用。 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠 菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致 病菌。 复发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里 有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸 形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色， 同时可看到管底通常有沉淀。
大肠菌群在VRBA上的菌落特征
大肠菌群 第二法的检验程序
• 8.3 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平 板，分别计数平板上出现的典型和可疑大 肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周 围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
大肠菌群 第二法的检验程序
BGLB肉汤证实试验 36℃±1℃ 18~24h 报告结果 注：VRBA(结晶紫中性红胆盐琼脂)又称为：VRB或VRBL
大肠菌群 第二法的检验程序
操作要点 • 8.1 样品的稀释按6.1进行（第一法）。 • 8.2 平板计数 • 8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个 稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取 1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。 • 8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶 紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平 皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混 匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃ 培养18 h～24 h。
质量控制
• 人员培训 • 标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC 25922 • 消耗性材料技术性验收
谢 谢！
大肠菌群检验流程图(MPN法)
检样(25g/ml样品+225稀释液） 稀释（10倍稀释）
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 36±１℃， 24~48±2h
不产气 产气 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃， 24~48±2h
不产气
大肠菌群阴性
产气
大肠菌群阳性
报告
大肠菌群检验(MPN法)
• 6.1 样品的稀释 • 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品， 放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min～ 10000r/min均质1 min～2 min，或放入盛 有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌 均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
大肠菌群检验(MPN法)
6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品 匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端 不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的 样品匀液。 • 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作， 依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀 释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样 品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
大肠菌群检验(MPN法)
• 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样 品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌 玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品 匀液。 • 6.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间， 必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl调节。
大肠菌群的定义
• 分布： –广泛分布于自然环境。 –来源于人和温血动物的粪便。 • 卫生学意义 –大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否 受到粪便的污染。 –大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污 染的程度。 –表示对人体健康是否具有潜在的危险性。
GB 4789.3－2010 大肠菌群计数
大肠菌群检验(MPN法)
• 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液 （液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种 1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤）， 36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气 泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未 产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵 试验。未产气者为大肠菌群阴性。
• 在一定培养条件下能发 酵乳糖、产酸产气的需 氧和兼性厌氧革兰氏阴 性无芽胞杆菌。 • 该菌群主要来源于人畜 粪便，作为粪便污染指 标评价食品的卫生状况， 推断食品中肠道致病菌 污染的可能。
大肠菌群的定义
• 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一 组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括： 大肠埃希氏菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、产 气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。 • 生化特征及血清学反应并非完全一致。
什么样的菌落必须要做证实试验? • 非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落 不符合的菌落。 • 被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如 牛奶、饮料等样品。本来大肠菌群的定义 是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类 混入了培养基，使得不能分解乳糖但能分 解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落， 所以需要进行证实实验。 • 挑选的比例……
大肠菌群 第二法的检验程序
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA） • VRBA的主要成分：乳糖、胆盐、结晶紫、 中性红及细菌生长所必需的营养成分如： 蛋白胨、酵母膏等。 • 结晶紫和中性红为VRBA的指示剂系统，在 酸性条件下为紫红色。 • 大肠菌群分解乳糖所产生的酸与胆盐结合， 可形成沉淀。
大肠菌群 第二法的检验程序
大肠菌群计数：第二法
适用范围与培养基 • 平板计数法相对于MPN法来说，检验结果 更精确。 • 适合用于污染比较严重的样品，但对于污 染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。 • 所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。
大肠菌群 第二法的检验程序
检样25g(mL)+225mL稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板 36℃±1℃ 18~24h 计数典型和可疑菌落
GB 4789.3－2010 食品微生物学检验 大肠菌群计数
标准名称
食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数 National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms
大肠菌群定义
BGLB复发酵
大肠菌群检验(MPN法)
注意事项 • 发酵试验判定原则：产气为阳性。 • 检测步骤减少（不必分离培养），检测时 间缩短24 h。 • 如接种量超过1 mL，则应用双料LST肉汤。
大肠菌群检验(MPN法)
• 6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索 MPN表（见附录B），报告每g（mL）样 品中大肠菌群的MPN值。
• 第一法MPN法 • 第二法平板计数法
大肠菌群计数：第一法
• 美国食品药品管理局（FDA）： Bacteriological Analytical Manual ， 2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria • ISO 4831:2006 Microbiology – General guidance for the enumeration of coliforms– Most probable numb胰蛋白胨（LST）
• 月桂基磺酸钠（十二烷基硫酸钠）能抑制革兰氏 阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。 • LST更容易观察。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀 有时候会使对产气情况的观察变得有些困难； • 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠 菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致 病菌； • 胰蛋白胨提供基本的营养成分； • LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉 汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。
• 8.4 证实试验 从VRBA平板上挑 取10个不同类型的典型 和可疑菌落，分别移种 于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB肉汤管产气，即 可报告为大肠菌群阳性。
大肠菌群 第二法的检验程序
• 8.5 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中 计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液 1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落， 挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性 管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g(mL)＝6.0×105 CFU/g(mL)
MPN表
MPN表注意事项
• 当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值 时，如：阳性管数为122，123，232，233 等时，建议增加稀释度(可做4～5个稀释度)， 使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点， 然后再遵循相关的规则进行查找，最终确 定MPN值。
检样量的选择注意事项
• 注1：本表采用3个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)]，每个稀释度接种3 管。 • 注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、 0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相 应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、 0.001g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数 字应相应增高10倍，其余类推。
第二法 平板计数法