中国生物工程杂志　China B i otechnol ogy,2006,26(2):79～82综 述长效重组蛋白药物的研究进展戚　楠3　马清钧(军事医学科学院生物工程所　北京　100850)摘要　重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短,目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理:1、增大蛋白药物分子量;2、利用血浆药物平衡;3、减少免疫原性。

针对构建突变体、PEG 化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法,及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。

关键词　长效重组蛋白药物　半衰期　分子量　药物平衡　免疫原性　突变体　PEG 化　血清白蛋白中图分类号　Q819收稿日期:2005212223 修回日期:20052122263电子信箱:qinan_8@hot m ail .com 重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类,临床上一般通过静脉和皮下注射给药。

经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解,导致活性降低,生物利用度低,要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药,不仅给患者带来不便,且易产生耐受性,耐药性及免疫原性等不良反应,因此临床上需要研制长效的重组蛋白药物。

目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理:1、增大蛋白药物的分子量,减少肾小球滤过率;2、利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点,缓慢释放游离型蛋白药物,使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动;3、减少异源蛋白的免疫原性,从而减少其体内清除率。

现将常用延长半衰期技术应用于重组蛋白药物的进展作一介绍。

1　构建突变体 通过构建突变体延长蛋白药物半衰期,常用方法有1、增加蛋白药物的糖基化程度,通过糖基化一方面在蛋白药物表面增加了侧链,增加蛋白质稳定性,阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用,另一方面使蛋白药物分子量增大,减少了肾小球滤过;2、通过形成缓释的微沉淀物,使释放游离型药物的时间延长。

其已经研制成功并上市的药物如重组人EPO 突变体(Amgen 公司的A ranes p )和重组人胰岛素的突变体(Aventis 公司的Lantus )。

重组人EP O 有3个N 糖基化位点(as p24,as p38,as p83),1个O 糖基化位点(Ser126)。

重组人EP O 的O糖基化与否与体内外活性及体内清除速率无关,而N 糖基化不完全的重组人EPO 体外活性正常,体内活性则降低到体外活性的1/500,且其体内清除率也明显加快。

N 糖基化EPO 对热和pH 变化稳定,等电点P I 为4.2～4.6,而未经糖基化EP O 等电点P I 为9.2[1,2]。

由此可以看出,N 糖基化对维持重组人EP O 活性和减少体内清除率有重要作用,在此基础上构建了重组人EPO 突变体A ranesp 。

A ranes p 有165个氨基酸,采用定点突变技术,将其中5个氨基酸位点进行了改变,而与重组人EPO 不同,即A la30A sn,H is32Thr,Pro87Val,Trp88A sn 和Pro90Thr,N 连接的寡糖链从原来的3条增加到5条[3],除as p24,asp38,as p83位点外,在30和88两个位点多了两个N 连接寡糖链,从而使分子量从原来的30kDa 增加到50kDa,在慢性肾衰病人中半衰期由原来的4～13h 延长到平均49h[4](27～89h )。

Lantus 是从大肠杆菌K12株表达的重组人胰岛素中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol.26No.22006的突变体,在人胰岛素A链第21个位点将A sp突变成Gly;在B链碳端最后第30个位点加两个A rg,使胰岛素等电点P I由原来的pH4.0变为pH6.7。

这种突变使其在酸性环境下为完全澄清溶液,一旦注入皮下组织(pH值提高)则因为等电点特性,变成不溶的微沉淀物[5],可持续释放,最终进入血液,形成一平稳、长时间、无尖峰的药物浓度曲线,趋近于正常生理胰岛素的基础分泌曲线。

和重组人胰岛素皮下注射后4～8h的持续时间相比,体内浓度相对恒定24小时以上[6],每天注射一次胰岛素即可。

2　PEG化修饰 PEG化(PEGylati on),即聚乙二醇(polyethylene, PEG)共价修饰蛋白质。

PEG化蛋白药物主要通过增加蛋白质的分子量,减少药物排泄,并且PEG可以作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇[7],减少免疫原性,减少体内清除率,PEG的屏障作用还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解[8],PEG化的这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。

PEG化学修饰方法可分为两代,第一代PEG化使用分子量≤12kDa的PEG分子,第二代PEG化采用分支的PEG[9]代替线性的PEG,增加偶联的PEG分子量,使偶联的PEG分子量达到60kDa[10],并且增加偶联的PEG数目,使每个PEG化位点可以偶联两个PEG分子。

第二代PEG化和第一代PEG化修饰相比,由于使用分支的PEG代替线性的PEG,减少蛋白酶和蛋白接触,在很大程度上减弱其水解作用;分支PEG对蛋白质屏蔽效应更为显著,使蛋白药物抗原性和免疫原性降低;更重要的是,随着偶联的PEG分子量的增大,体内清除率下降,血清半衰期得到了进一步的提高。

目前已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的L2天冬酰胺酶[11](Enzon公司的Oncaspar)、PEG化的I FNα2b[12](Schering公司的PEGIntron)、PEG化的I FNα2a[12](Roche公司的Pegasys)和PEG化的G-CSF[14](Amgen公司的Neulasta)。

它们经PEG修饰后的特征,见表1:表1　已上市的PEG化蛋白药物PEG修饰前后体内半衰期比较Table.1　Com par ison of ha lf li fe of prote i n drugs i n the market before m od i f i ed and post2m od i f i ed by PEGyl a ti on产品(商品名)平均分子量偶联的PEG平均分子量未PEG化的半衰期PEG化后的半衰期公司PEG化的L-天冬酰胺酶(Oncas par)143kDa5kDa20小时两周Enz onPEG化的I F Nα2b(PEGI ntr on)31kDa12kDa4～12小时40小时(22～60小时)ScheringPEG化的I F Nα2a(Pegasys)60kDa40kDa5.1小时(3.7～8.5小时)80小时(50～140小时)RochePEG化的G2CSF(Neulasta)39kDa20kDa 3.5小时15～80小时Amgen 除了上述这些已上市的长效PEG化蛋白药物外,处于临床前研究的还有:超氧化物歧化酶(即将上市, Enzon公司)、白介素22(Ⅱ期,Chir on公司)、水蛭素(Ⅱ期,BASF AG公司)等,预计这些重组蛋白药物在上市之后都会有预期的长效。

3　血清白蛋白融合 人血清白蛋白(human serum album in,HS A)是有585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质,分子量65kDa,它是人血浆中含量最高的蛋白质。

HS A本身就是许多内源因子和外源药物的载体,药物和血清白蛋白结合后,可以减少其生物利用度同时增加在体内的半衰期[15]。

大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短,而HS A有将近长达19天[16]的血清半衰期,并且HS A的基因在毕赤酵母中可以高效分泌表达,其发酵液表达量可以达到4g/L[17],上清液杂质含量较少,纯化方便,因此将蛋白质药物基因与HS A基因融合,在毕赤酵母或酿酒酵母中表达,获得HS A的融合蛋白,延长蛋白质药物的半衰期。

美国马里兰州人类基因组科学(HGS)公司已经进行一系列与HS A融合延长蛋白质药物半衰期的研究,其蛋白质药物HS A/I F N2α融合蛋白(A lbufer on2α)已完成Ⅱ期临床试验,正在研发的处于临床早期阶段的蛋白药物如HS A/I F N2β融合蛋白(A lbufer on2β)、HS A/rI L22融合蛋白(A lbuleukin)、HS A/rG2CSF融合蛋白(A lbugranin)、HS A/r HG H融合蛋白(A lbutr op in)。

A lbuferon2α[18]是HS A基因和IF N2α基因融合表达的蛋白,2005年4月在加拿大进行Ⅱ期临床试验,共有082006,26(2)戚　楠等:长效重组蛋白药物的研究进展56名病人,随机分成5个给药组(200mcg,450mcg, 670mcg,900mcg,1200mcg)。

临床试验结果表明, A lbuferon2α平均半衰期148小时,比Pegasys平均半衰期80小时(50～140小时)和PEGIntron平均半衰期40小时(22～60小时)更长。

它有很好的抗病毒活性,安全性和耐受性,PEGI FN与HS A2I FN的比较列于表2,病人用药后产生对HS A抗体为 1.7%,但未用药者存在HS A抗体达3.4%,并且在抗体产生副反应,抗病毒反应和药代动力学之间没有明显的相关性[19,20]。

表2　PEG I FN与HSA2I FN的比较Table.2　Co m par ison between PEG I FN and HSA2I FN抗病毒活性减少>2l ogI F N抗体产生I F N中和抗体产生PEGI F N42%6%～15%1%～5%HS A2I F N69%10.9% 2.5% A lbuferon2β[21]是HS A基因和I FN2β基因融合表达的蛋白。

在恒河猴体内,A lbuferon2β以 4.7～5.7m l/ h/kg皮下注射,其体内清除率大概比IFN2β要慢140倍。

和半衰期8小时的IF N2β相比,A lbuferon2β的半衰期是36～40小时。

A lbuleukin[22](分子量大约8118kDa)是HS A基因与重组人I L22(rI L22)基因融合表达的蛋白。

在小鼠体内,和19～57分钟半衰期的rI L22相比,A lbuleukin半衰期延长6～8小时。

静脉注射后,A lbuleukin清除率比rI L-2要慢50倍。

A lbugranin[23]是HS A基因和重组人G2CSF(rG2CSF)基因融合表达的蛋白。

小鼠实验表明,A lbugranin延长了半衰期和平均残留时间,减慢了清除率,三者分别是5. 6～5.7小时,16.7～20.7小时,和6.37～12.2m l/小时/kg,而rG2CSF相对应的是2.54小时,4.9小时,和164m l/小时/kg,。