有效地还原DHK 。在非洲菊( Gerbera hybrida) 中，DFR 能利用全部3种二 氢黄酮醇作为催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牵牛 中的原因。通过矮牵牛、玉米和金鱼草等植物DFR 基因序列的比对，发现 DFR 的底物结合特性是由一段保守序列决定的，其中134 位氨基酸是控制 DFR底物结合特性最为保守的氨基酸残基; Johnson 等也鉴定了DFR 与底物 专一性结合有关的区域，并通过改变该区域的一个氨基酸使DFR 优先催化 DHK。由此可见，DFR 的底物催化选择性是决定花色的主要原因。
二氢黄酮醇4－还原酶基因
学生：焦淑珍 导师：刘雅莉 2012--12--29
1
二氢黄酮醇4－还原酶基因的结构和作用机制
二氢黄酮醇4－还原酶（dihydroflavonol 4－reductase，DFR）属 于NADPH 依赖性短链还原酶家族，为单基因编码。最近鉴定了葡萄 （Vitis vinifera）DFR 的晶体结构，发现其是由3 个亚基组成的复合物， 具有专门的NADPH 结合域。DFR 是花青素生物合成途径的关键酶， 分别 催化二氢堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氢栎皮黄酮 （dihydroquercetin，DHQ） 和二氢杨梅黄酮（dihydromyricetin，DHM） 生成无色花葵素（leucopelargonidin）、无色花青素（leucocyanidin） 和无色翠雀素（leucodelphinidin），然后这些无色花青素在花色素苷合 成酶（anthocyanin synthase，ANS）和类黄酮3－O－糖基转移酶 （flavonoid 3－Oglucosyltransferase，3GT）的作用下合成各种花青素。 由于DFR 对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和 果色
4 DFR 基因底物的特异性
DFR 对底物的特异性和表达水平不同，使植物呈现出各异的花色和果色。
不同来源的DFR 对3 种底物的亲和性有差别，如矮牵牛DFR 主要催化DHM， 其次是DHQ，而对DHK 则无作用。在矮牵牛和兰花( Cymbidium hybrida) 中，
DFR 能有效催化DHQ 和DHM 并在花瓣中积累矢车菊素和飞燕草素，但是不能
5 DFR 基因底物特异性的分子基础
不同物种的DFR与底物的结合区域是高度保守的，DFR 的氨基酸序列 决定其底物的种类。研究发现，其第134 位的氨基酸残基直接决定底物 的特异性。根据DFR 的第134 位氨基酸残基的种类可分为3 种:①其134 位上有一个天冬酰胺残基( Asn) ，因此被称为Asn 型DFR。②其134 位 上有一个天冬氨酸残基( Asp) ，不能有效地把DHK 还原为无色花葵素， 这一类DFR被称为Asp 型DFR。矮牵牛和兰花( Bromheadia finlaysoniana)的DFR 属于这类;③其第134 位氨基酸残基既不是天冬 酰胺也不是天冬氨酸，因此被称为非Asn /Asp 型DFR。植物中Asn 型 DFR 分布广泛，单子叶植物中都是Asn 型DFR，Asp 型DFR 只分布在部 分双子叶植物中。此外 ,只有少数植物含有非 Asn ／Asp 型 DFR. 有 些同种植物中的不同 DFR 也分成不同的组 ,如豆科植物百脉根的DFR1 属于非 Asn ／Asp 型; DFR2 和 DFR3 则属于Asp 型;而 DFR4 和 DFR5 属于Asn型;苜蓿的 DFR1 属于Asn 型,而 DFR2则属于 Asp 型等 在比较几种重要植物的 DFR 时发现 植物界中的大多数 DFR 都是 Asn 型Asp 型和非 Asn ／Asp 型 DFR 数量有限 并且在进化上分布较远由 此推测 Asp 型和非 Asn ／Asp 型 DFR 有可能是由 Asn 型进化来的。
2
DFR基因的分离
DFR属于NADPH依赖性的短链DFR还原酶超家族 ，最早于1985年由O
Reilly等从玉米(Zeamays)和金鱼草(Antirrhinum m “s)中分离出 来 。随后，Beld等 在1989年又以部分金鱼草DFR表型突变基因为探 针分离了矮牵牛(Petunia hybrida)DFR基因。至今，通过同源克隆等
达模式，表明DFR基因仅在花色素苷着色器官中表达，并且控制花器 官的显色模式。
2000年Aida等 通过农杆菌介导的基因转染法将DFR基因转移到蓝猪耳
中，结果显示转化了反义基因的株系花冠变成浅蓝色，而转化了正义基
因的株系冠檐中的花色减少程度比冠筒的大。2004年Fukusaki等 成功 利用针对CHS基因的RNA干扰技术修饰了矮牵牛的花色，这项技术也可
能适用于DFR基因。
3 DFR 同源基因的结构
不同物种中编码DFR 基因的核苷酸序列也存在种属特异性，其功能可 能发生在转录和翻译阶段。据GenBank 上登录的资料，裂叶牵牛 ( I． nil) 与圆叶牵牛( I． purpurea) 基因组序列都包含3 个DFR 基 因: DFR-A、DFR-B 与DFR-C，它们呈串联排列，并且都是由6 个外显子 组成，具有相同的内含子剪切位点，DFR-B 基因比DFR-A、DFR-C 有更长 的内含子序列; 矮牵牛基因组中含有3 个DFR 基因，分别定位在2、4、6 号染色体上; 金鱼草、拟南芥的DFR 基因由6 个外显子组成，内含子剪 切位点与牵牛花的是一致的; 高梁基因组中含有2 个DFR 基因，呈串联 排列; 蔓越橘的基因组含有2 个DFR 基因，代表2 个不同的座位，在编 码的氨基酸序列中， 24 个氨基酸有差异。由此可以看出，不同种属的 DFR 氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差异，分析DFR 同源基因的结 构对研究其种属间的功能至关重。
方法，已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、兰花(Bromheadia
finlay—soniana)、山茶(Camellia sinensis)、番茄 (Lycopersiconesculentum)和水稻(Oryza sativa)等植物中分离了
DFR基因。2003年Nakatsuka等分了亚洲百合品种DFR基因的时空表