燕 德 起
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血清总胆红素和结合胆红素测定
改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红 素 胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆 红素
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素
【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试 剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红 素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠 作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮 试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重 氮反应pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使 紫色偶氮胆红素(吸收峰530nm)转变成蓝 色偶氮胆红素，在600nm波长比色，使检 测灵敏度提高。
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂】
1．咖啡因-苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g， 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.5g，溶于约500ml去离子水中， 再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解(加入咖啡因后不能加热溶解)， 用去离子水补足至1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。 2．碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠 (Na2C4H4O6?2H2O)263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。 置塑料瓶中，室温保存。 3．72.5mmol/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠5.0g，用去离子水溶解 并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3个 月。作10倍稀释成72.5mmol/L，冰箱保存，稳定期不少于2周。 4．28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸 (NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸 15ml，用去离子水补足至1L。 5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶 液20ml，混匀即成。 6．5.0g/L叠氮钠溶液。
改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素
【操作步骤】
混匀后，波长600nm，对照管调零，读取吸光度， 在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。 6
改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素
标准曲线制作
混匀(不可产生气泡)，按总胆红素测定法操作。 每一浓度作3个平行管，并分别做标准对照管，用各自 的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准 液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一 吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度， 7 然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线
【注意事项】 1．BOD浓度的选择 文献报道BOD在反应液中 终浓度为0.18～1.14U/ml。国内有些厂家 的试剂盒，BOD在反应液中终浓度按标示值 计算很高，但反应速度很慢。 2.选择BOD浓度时，可根据所用制品在测定高 胆红素血清标本或342μmol/L标准液的反 应速度，即能否在5min反应完全而确定。 由于测定结合胆红素时反应液pH偏离BOD的 最适范围，因此要求BOD有较高的浓度，一 般使反应液中终浓度不低于0.5U/ml。
4．本法灵敏度高，且可避免其它有色物质的干扰，是测定 血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。 现有些商品试剂盒称咖啡因法或J-G法，但不加碱性酒石 酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不如上述 方法。
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胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
【原理】 胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。胆红素氧 化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化， A450nm下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在 pH8.0条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化， 因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素含量； 加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。 在pH3.7～4.5缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素 (mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分δ胆红素 氧化，非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。用 配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin， DTB)作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可 反映结合胆红素的含量。
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胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
【注意事项】 3．Hb在1.0g/L以下时，对结果影响不大。每升血清中分别 加入维生素C 0.1g、半胱氨酸0.5g、谷胱苷肽0.5g、尿素 0.5g、尿酸0.5g、葡萄糖10g、乙碘醋酸1g、白蛋白40g对 总胆红素及结合胆红素测定几乎无干扰。每升血清中加L多巴0.15g、α-甲基多巴0.15g使结果偏低约10%。 4．BOD的最适pH 在pH7.3～9.0之间酶活性的pH曲线变化幅 度不大，但最适pH为8.0～8.2。但在测定结合胆红素时， 为防止Bu反应，选择pH为4.5，这时样本中mBc、dBc及大 部分δ胆红素被氧化；pH低于4.0时，血清样本易发生混 浊，严重干扰测定结果；郭健等报道，用枸橼酸盐、磷酸 盐、硼酸盐和碳酸盐缓冲液比较时，枸橼酸盐缓冲液 (0.1mol/L，pH5.0)效果最好。
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素
【注意事项】
5．标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时 可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。 6．胆红素大于342μmol/L的标本可减少标本用量，或用 0.154mmol/L NaCl溶液稀释血清后重测。 7．结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参 考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不 同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应 少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素 反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这 是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的 情况下，问题更复杂。
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素
【注意事项】
1．胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。 2．轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果 偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物 可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋 白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰， 应尽量取空腹血。 3．叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠 作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至 不呈色。 4．本法测定血清总胆红素，在10～37℃条件下不受温度 变化的影响。呈色在2h内非常稳定。
改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素H
【评价】
3．重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇(M-E法)或二甲亚砜 等作加速剂，可做成单一试剂，反应pH和显色pH都在酸性， 560nm波长比色，易于自动化。但灵敏度比改良J-G法略低， M-E法摩尔吸光系数为60 500，Hb干扰较明显，Hb＞1g/L 时，需用样品空白校正。
胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
【计算】 血清总胆红素(μmol/L)＝
×C总胆红素
血清结合胆红素(μmol/L)＝ ×CDTB 【参考范围】 与重氮法相似， 总胆红素为10.26±4.10μmol/L(n=97)， 结合胆红素为2.57±2.56μmol/L(n=95)。
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பைடு நூலகம்
胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【临床意义】 2．血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素 与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。 • (1) 比值＜20% 溶血性黄疸，阵发性血红 蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。 • (2) 比值40%～60% 肝细胞性黄疸。 • (3) 比值＞60% 阻塞性黄疸。 • 但以上几类黄疸，尤其是(2)、(3)类之间 有重叠。
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胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
【操作步骤】 总胆红素和结合胆红素测定分别按表
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胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素
加入BOD工作液后立即混匀，置37C水浴5min，用 分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，读取各 管吸光度(A)。用于对照管的比色杯与非对照管的比 色杯不得混用。 17
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素H
【评价】 1．灵敏度和线性范围 本法摩尔吸光系数为74 380，标本 中胆红素17.1mol/L时吸光度约0.08(血清用量已达0.2m1)， 正常血清总胆红素多数小于17.1mol/L，手工法测定显得 灵敏度很不够。在病理血清结合胆红素增高在 17.1μmol/L以下时，灵敏度同样不够。线性上限虽可做 到1.7吸光度，但手工法在胆红素超过171μmol/L时，吸 光度已达0.8，应减量操作。分析仪检测灵敏度高得多， 最低吸光度可测至0.02，线性上限可达342μmol/L；但本 法需3次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。 2．精密度 正常浓度时精密度较差，特别是批间CV，据报 道为14%～20%；而胆红素342μmol/L时，精密度佳，批内 CV为0.95%，批间CV5%～10%。 12
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改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素 【试剂】
7．胆红素标准液 • (1) 目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须 用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下： • 收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时 可用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小 于0.04。 • (2) 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液， 在25℃条件下，光径1.000±0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系 数应在60 700±1 600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光 系数应在74 380±866。 • (3) 胆红素标准贮存液(171μmol/L) 准确称取符合要求的胆红 素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入 0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容 量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入 0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇(勿用力摇动，以免产生气泡)。最 后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸 包裹，置4℃冰箱3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。 5