高产菌株选育及GI的改造 高产菌株选育及 的改造
美国 ：嗜水假单胞杆菌、短乳杆菌、 戊糖乳酸菌 日本 ：暗色链霉菌 、白色链霉菌 中国 ：玫瑰暗黄链霉菌、玫瑰红链霉菌、 高温放线菌M1033、密苏里游动放线菌 • 目前普遍葡萄糖异构酶生产菌种酶活低、 胞外酶含量较高
• 通过定点突变对葡萄糖异构酶进行改造， 改善其热稳定性，如Mrabet构建的密苏 里游动放线菌GI突变酶体K253R的半衰 期增为野生型的3倍。而AM GI突变体 E186Q的最适pH比野生型下降一个单位， 且活性提高两倍。 • 通过改变GI底物专一性，提高其催化效 率，如嗜热产硫梭状芽孢杆菌GI的定点 突变体W139F的催化效率大大提高
异构化机理
• 高果糖浆是自60年代崛起的新食糖资源， 味道纯正，具有较强的保温性、着色性 和防腐性，营养价值较高，可不经消化 直接被肠胃吸收，果糖的代谢不受胰岛 素调节，糖尿病人可以利用，是饮料、 糕点等食品工业的理想用糖。
• 高果糖浆的工业制造在全世界范围内尤其是在 发达国家发展极快，现美国的高果糖浆消费量 已与蔗糖持平。果葡糖浆的应用领域主要是食 品工业，还有医药和饮食业，根据商业部对蔗 糖消费的预测和果葡糖浆在各行业中的代用量 推算， 目前我国果葡糖浆的潜在销售市场为 150万吨干基。从长远观点看，果葡糖浆将成 为我国一个新的主要糖源，它将从根本上解决 我国糖源短缺问题。
• 木糖异构化以及发酵的同步性
反应平衡时木酮糖与木糖的比率只有1：5，所以木糖的同步异构 及发酵更优先考虑异构化条件。木酮糖由酵母发酵为乙醇的同时， 也更易于木糖向木酮糖的转化平衡。适宜于木糖的同步异构以及 发酵的pH为5.5或6.0，乙醇是最终产物。木糖同步异构及发酵中 若得率不高可能与酶量不足及木糖、木酮糖、乙醇的抑制有关
异源表达
• 大肠杆菌是最常用的异源表达宿主菌。
以地衣芽孢杆菌染色体的EcoRⅠ片段克隆入pBR322， 再转化GI缺陷型E.coli菌株，得到含有GI基因的重组质 粒十分稳定，其酶活比野生型高20倍。 用穿梭质粒载体pSE-3将大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在 变铅青链霉菌中表达，稳定性良好。重组质粒在大肠 杆菌和链霉菌中均能表达，但在链霉菌中酶活性略低 于在大肠杆菌中，同时穿梭质粒载体pSE-3的新霉素抗 性在大肠杆菌中比在链霉菌中高出约3倍，可能是与载 体本身在这两种受体菌中的表达强度有关
底物专一性
• GI除了D-葡萄糖和D-木糖以外还能以D核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛 糖和脱氧葡萄糖以及葡萄糖C-3、C-5和 C-6的修饰衍生物为催化底物。但GI只能 催化D-葡萄糖或D-木糖α-旋光异构体的 转化，而不能利用β-旋光异构体作为催 化底物
金属离子的影响
• 二价金属离子对 的活力及稳定性影响 二价金属离子对GI的活力及稳定性影响 很大
葡萄糖异构酶的生物学性质
热稳定性 底物专一性 金属离子的影响 最适pH和最适温度 最适 和最适温度
• • • •
热稳定性
• 不同生物来源的葡萄糖异构酶热稳定性 不同
乳酸杆菌和埃希杆菌GI的热稳定性较差 GI 链霉菌和枯草芽孢杆菌GI在高温下相当稳定 嗜热高温菌GI的热稳定最高，可能是它对Val和Pro等 氨基酸的偏爱选择，使其具有更紧密的空间结构，而 这些氨基酸在其他GI中则被替代
同源表达 异源表达
• 高产菌株选育及 的改造 高产菌株选育及GI的改造
葡萄糖异构酶基因序列
• GI的序列同源性在相近种属中较高，不 同种属则较低。
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GI与链霉菌的同源性仅为 24.2%和26.3% 深灰色链霉菌与紫黑色链霉菌GI的同源性为86.6%，密 苏里游动放线菌和小瓶属菌株GI同源性达到93.4%
链霉菌中的D-木糖操纵子 链霉菌中的 木糖操纵子
• 链霉菌的D-木糖操纵子研究还不太多
在紫黑链霉菌中存在着一个调节蛋白（xylR）的阅读 框，xylA和xylB基因转录方向相同。但具体的调控机 制尚不清楚。 在锈赤链霉菌中，xylA和xylB基因相邻，但分开转录， 方向相反
• xyl基因的转录受木糖的诱导和葡萄糖的 阻遏
GI基因在链霉菌中的表达 基因在链霉菌中的表达
• 同源表达 • 异源表达
同源表达
• 在变铅青链霉菌中，同源克隆来自暗色 链霉菌的GI，结果GI活性大大提高。为 避免无选择压力下，由于质粒的不稳定 性而造成GI的表达不稳定，还可将链霉 菌启动子P1克隆到xylA的上游，再将P1xylA基因通过整合载体pTS55整合入染色 体。整合菌株CBS1在无糖条件下，GI活 性大约是需要木糖诱导的野生型GI的7倍
GI工业生产应用 工业生产应用
• 果葡糖在50年代后期由日本试制成功，70年代初期， 以淀粉为原料的果葡糖浆便应运而生，首先是美国进 入工业化生产，而后日本、西德、法国等国家先后投 入生产 • 到目前为止全世界有美国、加拿大等20多个国家和地 区生产果葡糖浆，并且随着生产技术和工艺的不断改 进，果葡糖的成本不断下降。 • 近年来，虽然蔗糖的价格下跌，但果葡糖浆工业已发 展壮大，其价格仍可低于蔗糖10%~15%。从生产上看， 果葡糖浆工业虽然只有20多年的历史，但发展速度相 当惊人。其中产量最大的首推美国，约占世界总产量 的72 %。
分离纯化以及工业化生产
• 分离提纯 • 固定化 • GI工业生产应用 工业生产应用
分离提纯
• 酶的提取是指在一定条件下，用适当的 溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶 充分的溶解到提取液中的过程。 • 酶的提取方法：盐溶液提取法、碱溶液 提取法和有机溶液提取法 • 提取液中含有多种酶，要想从提取液中 分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶 的特性，选择合适的分离纯化方法
双层固定化异构酶的制备
• 靠静电相互作用将葡萄糖异构酶分子吸附到TMPS载体上，同时 载体表面电荷由正转为负，然后用去离子水洗涤。 • 取60L葡萄糖异构酶于1000L带搅拌的容器中，用去离子水稀释10 倍，搅拌均匀后，用Na2CO3 调pH7～8。将合成好的TMPS 200kg 用5%HCl浸泡30 min，用去离子水冲洗至中性，加入配好的稀释 酶液中，缓慢搅拌，控制pH 7～8，稳定2～3 h，将剩余酶液去除， 用去离子水洗涤。 • 将上述固定化单层葡萄糖异构酶浸入二碘化六亚甲基-双-三甲铵 溶液中，使葡萄糖异构酶表面又沉积一层双极性阳离子，同时其 表面电荷又由负转为正，再用去离子水洗涤。 • 将表面电荷为正电的单层葡萄糖异构酶再浸入异构酶溶液中，使 酶沉积到双极性阳离子层表面，去离子水洗涤以除去未吸附的酶 分子。 • 为防止已吸附的酶分子从载体上脱落，以0.3%戊二醛交联双层固 定酶(室温下交联2 h)，去离子水(10倍载体重量)洗涤除去游离的 戊二醛，即得双层固定化异构酶。
• 葡萄糖异构酶常用的分离纯化方法有分 子筛、DEAE-FF和透析
DEAE-FF是离子交换层析的一种，离子交换树脂为纤 维素类 透析在纯化中极为常用，透析膜的截留分子量为5000 左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险。在 纯化中可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等 不同菌源产生的葡萄糖异构酶纯化的条件不同。 从短杆菌得到的GI通过MnCl2处理，(NH4)2SO4分 级盐析，热处理以及用DEAE-葡聚糖凝胶柱层析而部 分纯化 凝结芽孢杆菌HN-80产生的葡萄糖异构酶经过 MnSO4处理，(NH4)2SO4分级盐析及DEAE-葡聚糖凝 胶柱过滤而被纯化
链霉菌葡萄糖异构酶的发酵 生产概况
王海燕 112000
综述框架
综述
前言
生物学性质
GI基因在链霉菌中的克隆表达 基因在链霉菌中的克隆表达
分离纯化以及工业化生产
热稳定性
葡萄糖异构酶基因序列
分离提纯
底物专一性
链霉菌中的D-木糖操纵子 链霉菌中的 木糖操纵子
固定化
金属离子的影响GI基因再链来自菌中的表达 基因再链霉菌中的表达
• 葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接 用其菌体进行反应。 • 提取胞内酶，首先要破碎细胞然后将含 有酶活性的部分用过滤或离心法去除残 留细胞和细胞碎片，从而得到澄清溶液。 再采用逐步逐级分离和浓缩等步骤将所 得的无细胞提取液纯化。 • 常用破碎处理方法：机械破碎法、物理 破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
固定化
• 提取和分离提纯的酶制成酶制剂
将葡萄糖异构酶的酶液进行干燥处理，加入适量的稳定剂和 填充剂，就可以用来催化化学反应。 酶制剂和产物是混合在一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂 也不能重复利用
• 固定化葡萄糖异构酶
一直是酶工程领域中研究的最为活跃的课题，现已产生上百 种方法，但工业上实际应用的只有戊二醛交联法、载体吸附法、 包埋法以及细胞凝聚法等。 载体吸附法具有方法简单、酶活力回收高和载体可重复利用等 特点，因此应用的最为广泛
双层固定化
• 无论是载体吸附法还是目前采用的其他方法都 只能在载体表面固定化单层酶，固定化酶活力 会受载体表面积大小的限制。 • 分子沉积是利用阴阳离子相互吸引的原理，采 用有机两亲性阴阳离子或聚电解质在带电的基 片表面上交替沉积，制备有机分子的多层超薄 膜。 • 葡萄糖异构酶的等电点在pH5 左右。因此在中 性条件下，异构酶分子带负电荷，它可以代替 阴性聚电解质与双极性阳离子在载体上交替沉 积而把酶双层固定在载体内
• 我国对α—淀粉酶、葡萄糖异构酶的研究 取得了可喜的成就。但由于一些因素的 影响，我国果葡糖浆工业尚未形成一定 规模，其主要问题是：
果葡糖生产技术尤其是酶制剂未完全过关 原料价格过高迎香生产成本 果葡糖浆价格高
工业生产总结
• 增加果糖的含量
在高果糖浆的生产中，葡萄糖转化率约50%，而工业应用要求果 糖含量高于50%，提高反应温度及降低反应pH可增加果糖得率。 单一pH过程即指HFCS生产中的玉米淀粉、α-淀粉酶及脱支酶的 液化、糖化和异构化在同一pH下进行，约为4.5~5.0，因此酸、热 稳定的GI能减少高温下有色碳酰副产物的生成，提高HFCS生产 效益