２０１５年１１月 发酵科技通讯 第４４卷第４期 葡萄糖异构酶基因的筛选、表达 及酶学性质研究
廖承军’，郑微 ，黄建峰 。刘成龙 ，柳志强 ，程新平’。毛宝军’，陈德水’ （１．浙江华康药业有限公司，浙江衢州３２４３０２；２．浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州３１００１４）
摘 要：通过基因挖掘的方法从ＮＣＢＩ数据库中筛选得到一株嗜热的葡萄糖异构酶（ＧＩ）产生 茵株Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ一１，化学合成该酶的基因并在大肠杆菌Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２ｌ（ＤＥ３）中 进行可溶性表达。重组葡萄糖异构酶经过Ｎｉ—ＮＴＡ柱亲和层析分离纯化后，对纯酶进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ检测．结果显示为单一条带，其分子量大小为５０．８ ｋＤａ。测定了该重组酶对底物Ｄ一葡萄 糖的活力为１９．８ Ｕ／ｍｇ，并对其酶学性质进行了表征。该酶最适温度和ｐＨ分别为８５ ｃＩ二和７．０， Ｃｏ２＋对催化活力起着非常重要的作用，对底物Ｄ一葡萄糖的 值和 一值分别为３７３ ｍｍｏｌ／Ｌ 和１３．４ Ｕ／ｍｇ。在最适条件下，反应在４ ｈ内达到平衡，果糖得率最高达到５３．８％。 关键词：基因挖掘；葡萄糖异构酶；表达；酶学性质 中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７４—２２１４（２０１５）０４—００１９—０５
Ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ－１
ＬＩＡＯ Ｃｈｅｎ￣ｕｎ ，ＺＨＥＮＧ Ｗｅｉ ，ＨＵＡＮＧ Ｊｉａｎｆｅｎｇ ，ＬＩＵ Ｃｈｅｎｇｌｏｎ￣，ＬＩＵ Ｚｈｉｑｉａｎｇ ， ＣＨＥＮＧ Ｘｉｎｐｉｎｇ ，ＭＡＯ Ｂａｏｊｕｎ ，ＣＨＥＮ Ｄｅｓｈｕｉ （１．Ｚｈ￣ｉａｎｇ Ｈｕａｋａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｑｕｚｈｏｕ ３２４３０２，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈ＠ａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｈｙｐｅｎｈｅｒｍ０ｐｈｉｌｉｃ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ一１（ＴＰＧＩ）ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ＴＰＧ１ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ—ＮＴＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＴＰＧＩ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｎｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ａｒｏｕｎｄ ５０．８ ｋＤａ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＴＰＧＩ ｔｏ Ｄ— ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ １９．８ Ｕ／ｍｇ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｉｔｓ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ８５ ｏＣ，ｐＨ ７．０ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏ２￣．Ｔｈｅ Ｋ ａｎｄ —ｔｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ ｗｅｒｅ ３７３ ｍｍｏ］］Ｌ ａｎｄ １ ３．４ Ｕ／ ｍｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｒｅａｃｈｅｄ ５３．８％ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｆｔｅｒ ４ ｈ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ；ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
收稿日期：２０１５—０５—２８ 基金项目：国家自然科学基金（３１４０１５２７）；浙江省重大科技攻关项目（２０１３Ｃ０２０２７） 作者简介：廖承军（１９７６一），男，浙江开化人，工程师，主要从事功能性糖和糖醇生产工艺技术开发和应用，Ｅ－ｍａｉｌ ｌｉａｏｅｈｅｎｇｊｕｎ＠ｈｕａｋａｎｇｐｈａｒｍａ．ｅｏｍ． 发酵科技通讯 第４Ｊ４卷 引言 葡萄糖异构酶（ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＥＣ ５．３．１．５） 又称木糖异构酶（ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），在体内催化 Ｄ一木糖生成Ｄ一木酮糖．在体外催化Ｄ一葡萄糖生 成Ｄ一果糖…。因此，该酶被广泛用于高果糖浆 （ＨＦＣＳ）的工业生产中＿２＿３】。 目前，工业化生产的ＨＦＣＳ均为４２％ＨＦＣＳ， 而５５％ＨＦＣＳ因其口感和甜度等性能拥有最大 的市场需求 ］。要得到５５％ＨＦＣＳ，需要经历下游 色谱纯化和浓缩等步骤【６ｌ。研究报道显示，葡萄糖 和果糖之问的异构化反应存在着热动力学平衡， 随着反应温度的升高，转化率也逐渐升高，当温度 大于等于８５℃时，理论转化率可以达到５５％以 上ｌ７ 。因此，筛选构建一株高活力且耐高温的葡 萄糖异构酶，已成为实现一步法生产５５％ＨＦＣＳ 的迫切需求。 目前，基因挖掘作为一种快速、高效、便捷的 筛选生物酶催化剂的新型手段，已经越来越广泛 地被使用并代替传统的土样筛选 。 本课题组通过基因挖掘的方法从ＮＣＢＩ数据 库中筛选得到一株嗜热的葡萄糖异构酶（ＧＩ）产生 菌株Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ一１，化学合成该 酶的基因并实现其在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３）中的可溶性表达。利用亲和层析实现了重 组葡萄糖异构酶ＴＰＧＩ的分离纯化，并从最适反 应温度、最适ｐＨ、最适金属离子及酶促反应动力 学等方面研究了该酶的酶学性质。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 菌株和载体 宿主大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３））为本实验室 保存菌株，表达载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）购自Ｔａｋａｒａ公司。 １．１．２试剂 限制性内切酶ＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ ＤＮＡ连接 酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司； ＤＮＡ聚合酶、ｒａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ购自上海申能博彩公司；质粒 ＤＮＡ小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购 自Ａｘｙｇｅｎ公司；异丙基一Ｂ—Ｄ一硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；酵母粉、蛋白胨购自 ＯＸＯＩＤ公司；Ｄ一葡萄糖购自阿拉丁试剂有限公 司；Ｄ一果糖购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司。除特别注明的试剂 ———● 外，其他各种实验试剂均为国产分析纯。 １．１．３ 引物 根据ＴＰＧＩ基因序列，设计引物（含限制性酶 切位点）上游引物：５ 一ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴ ＧＧＡＡ１］＿Ｉｒ订ＣＣＣＴＧ一３ ，（Ｎｃｏ Ｉ），下游引物：５ 一 ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＡＴＴＧ一３ ，（ ０ Ｉ），以上引物均由上海生工生物工程公司合成。 １．１．４培养基 ＬＢ培养基（ｇ／Ｌ）：蛋Ａ胨１０，酵母粉５，ＮａＣ１ １０，ｐＨ ７．０，接种之前加入５０￣ｇ／ｍＬ卡那霉素；固 体ＬＢ培养基添加１．５％～２．０％琼脂，用于大肠杆 菌培养。卡那霉素抗生素贮存液的配制：用无菌水 配制５０ ｍｇ／ｍＬ的抗生素母液，过滤除菌后，一２０ ｏ【＝ 保存备用，使用时终浓度为５０ ｐ￣ｇ／ｍＬ。 １．２方法 １．２．１基因挖掘方法筛选葡萄糖异构酶 以最嗜热的Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ来源和催化 活力较高的商业化的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ来源 的葡萄糖异构酶（ＴＭＧＩ、ＳＭＧＩ）氨基酸序列为模 板，从ＮＣＢＩ数据库中（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），通过Ｂｌａｓｔ Ｘ和Ｂｌａｓｔ Ｐ比对搜索， 最终选择了一株与上述ＴＭＧＩ、ＳＭＣＩ同源性分别 为９８％、３１％，且无研究报道的嗜热Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ一１来源的葡萄糖异构酶。 １．２．２ 葡萄糖异构酶基因的密码子优化及其合成 选取的葡萄糖异构酶基因通过软件Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ，以Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）的密码子 偏好性为基准，进行密码子优化，优化后的基因由 上海旭冠生物科技发展有限公司合成。 １．２．３重组葡萄糖异构酶的构建 以合成的含有目的基因的质粒为模板，ＰＣＲ 扩增葡萄糖异构酶基因，扩增条件为：９５℃预热 变性５ ｍｉｎ，３０个循环（９４℃变性３０ Ｓ。５０℃退火 ３０ Ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ），７２℃延伸１０ ｍｉｎ。扩增后 的产物经０．９％琼脂糖凝胶电泳检测分析并回收， 回收后的ＰＣＲ产物纯化后与表达载体ｐＥＴ一２８ｂ （＋）连接，连接产物转化Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态 细胞．经菌落ＰＣＲ验证为阳性克隆子的菌，送至 上海桑尼生物技术有限公司测序验证，通过 ＤＮＡＭＡＮ软件分析测序序列是否为目的序列。 １．２．４重组葡萄糖异构酶的诱导表达及ＳＤＳ— ＰＡＧＥ分析 制备种子液：用接种环从斜面上挑取鉴定正 第４期廖承军，郑微，黄建峰，刘成龙，柳志强，程新平，毛宝军，陈德水：葡萄糖异构酶基因的筛选、表达及酶学性质研究 ２．２．５ 重组葡萄糖异构酶催化葡萄糖反应进程 重组葡萄糖异构酶ＴＰＧＩ催化葡萄糖生成高 果糖浆的反应进程研究表明（图７），果糖得率随 着时间的增加快速上升，反应１ ｈ，果糖得率就 能达到４２％，２ ｈ得率能够达到５０％，且在４ ｈ 达到最大值５３．８％，之后反应达到平衡，得率趋于 稳定。
图７重组葡萄糖异构酶的催化葡萄糖的反应进程 ３ 结论 本文通过基因挖掘的方法从ＮＣＢＩ数据库中 筛选得到一株嗜热的葡萄糖异构酶（ＧＵ产生菌株 Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ ＲＫＵ一１，化学合成该酶的基 因并在宿主大肠杆菌Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行 可溶性表达。重组葡萄糖异构酶ＴＰＧＩ经过Ｎｉ— ＮＴＡ柱亲和层析分离纯化后，对纯酶进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ检测，结果显示为单一条带，其分子量大小 为５０．８ ｋＤａ。测定了该重组酶对底物Ｄ一葡萄糖的 活力为１９．８ Ｕ／ｍｇ，并对其酶学性质进行了表征。 确定了该酶的最适温度和ｐＨ分别为８５℃和 ７．０．与之前一些文献报道的葡萄糖异构酶相比， 拥有较高的催化最适温度和不依赖碱性条件催 化［ｉｔ一１２１。金属离子中Ｃｏ 对该酶的催化活力起着非 常重要的作用．对底物Ｄ一葡萄糖的 值和 一 值分别为３７３ ｍｍｏｌ／Ｌ和１３．４ Ｕ／ｍｇ。在最适条件 下，反应在４ ｈ内达到平衡，果糖得率最高达到 ５３．８％。后续可通过计算机软件模拟和分子改造 技术进一步改变该蛋白的特性，提高与底物的亲 和力和催化效率，并寻找一种合适的固定化方法 稳定酶的使用率，将使工业化大规模一步酶法生 产５５％ＨＦＣＳ成为可能。