万方数据万方数据万方数据菌种保藏中的细菌鉴定方法作者：杜昕波， 赵耘， 李伟杰， DU Xin-bo， ZHAO Yun， LI Wei-jie作者单位：中国兽医药品监察所,北京,100081刊名：中国兽药杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY DRUG年，卷(期)：2009，43(3)引用次数：0次1.兽医微生物学 20052.医学微生物学实验技术 20063.程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2006(5)4.杜昕波.赵耘.李伟杰.康凯.陈敏.张媛利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究[期刊论文]-中国兽药杂志2008(9)5.原核生物系统学 20076.常见细菌系统鉴定手册 20011.学位论文杜蓉分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究与应用2008结核病具有高流行性和高传染性，至今仍是一个严重的公共卫生问题。
WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，据估计全球约有1/3的人感染结核菌，每秒有1个新增病例（WHO，2006年）。
分枝杆菌在微生物分类中属于放线菌目、分枝杆菌科，临床主要致病的是结核分枝杆菌（MTB），此外还有非结核分枝杆菌（NTM），NTM所引起的结核样病变与结核临床表现相似，但治疗方案和抗药性根据不同种属有所不同。
因此对分枝杆菌做出及时准确的分型鉴定、检测对控制结核病疫情具有十分重要的现实意义。
分枝菌酸（MA）是一类高分子量的含有α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物，是所有分枝杆菌细胞壁脂质的主要组分，其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及其含量与生物种型有关，且各生物种型之间MA呈现指纹特征。
本论文的目的是通过采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析比较样品中MA之间的差异，建立快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的HPLC标准方法，并构建分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。
全文分为四章： 第一章前言，简要介绍了分枝杆菌分型鉴别及检测方法的研究现状和存在问题，尤其介绍了HPLC方法的应用。
并在此基础上提出了本论文的研究目的和研究内容。
第二章建立了以甲醇和二氯甲烷为流动相的梯度洗脱RP-HPLC法。
分枝杆菌经过接种、培养、皂化、酸化及衍生化后，采用RP-HPLC进行分析，建立了快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的RP-HPLC标准方法。
第三章采用第二章所建立的方法，构建了49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株（来源于ATCC（美国标准菌种收藏中心））的MA指纹谱库。
通过对各个谱图进行详细分析，依据峰的分布特点可将其分为单簇（14种）、双簇（23种）、三簇及多簇（12种）三类，而后根据相对保留时间和相对峰高比的比例进行种间水平鉴别。
此法成功鉴别了41种分枝杆菌（其余8种难以采用此法准确鉴别），对于难以鉴别的部分菌种尝试采用GC法对其进行进一步分型鉴别。
第四章在完成第二、三章工作的基础上，使用所建立的方法亦测定了大量来源于DSMZ（德国菌种保藏中心）的分枝杆菌（包含未收录入《伯杰细菌鉴定手册》的菌种）的MA 指纹图谱，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。
2.期刊论文程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉.Cheng Chi.Yang Mei.Li Jinxia.Yao Su.Hu Hairong Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究-食品与发酵工业2006,32(5)Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统,以细菌对微平板上95种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定.目前我国已经累计引进100余台,但使用率较低.文中在总结实践经验的基础上,参阅最新Biolog系统操作手册4.2版和国家微生物资源平台技术规程的统一格式,研究制定了细菌鉴定的操作规程,以规范系统使用,获得准确鉴定结果,尽快提高我国Biolog系统的应用水平.3.学位论文刘晗黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性2006寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内，是重要的信息物质，参与多种生命活动。
寡糖由于结合位置和结合类型的不同，种类繁多，有着多种重要的生物活性。
黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖，而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性，至今少见报道。
首先，本文对一株从野外筛选到的分泌黄原胶酶的菌株进行了鉴定，根据该菌株形态特征、生理生化特征，对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定它属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。
16SrRNA序列测定结果也支持这一结论。
该菌已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCCNO.1421)。
其次，通过对Sphingomonassp.XT-11发酵条件的研究，筛选出有利于产酶的各实验因子的适宜水平。
结果表明，酶形成的适宜温度为30℃，培养基适宜起始pH值为7.0，培养基适宜底物浓度为1﹪，摇瓶发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。
适宜种龄为16～24h，接种量对发酵影响不大。
再次，对黄原胶寡糖在抗氧化、抑制皮肤浅部真菌、植物诱抗、抑制ACE方面的生物学活性进行了探索，发现粗酶液降解得到的粗黄原胶寡糖拥有较强的抗氧化能力，而对ACE则没有抑制作用；黄原胶寡糖还拥有了较强的抗皮肤浅部真菌活性以及一定的植物诱抗活性。
最后，对鞘氨醇单胞菌XT-11红细胞凝集活性进行了研究。
发现该菌悬液能凝集2种血红细胞。
菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。
其凝集活性不依赖于Ca2+；在pH为6.0～10.0范围内较稳定；它的凝集活性在60℃时完全丧失。
4.期刊论文张海燕.贺江舟.龚明福.刘占文.张利莉.Zhang Haiyan.He Jiangzhou.Gong Mingfu.Liu Zhanwen. Zhang Lili利用菌落PCR-DGGE快速鉴定盐渍土壤菌种多样性-塔里木大学学报2007,19(4)利用菌落PCR方法,结合DGGE的检测方法,对所保存的87份盐生菌的培养物进行了多样性检测,初步研究显示至少有31株不同的菌种,表明新疆盐生环境存在较为丰富的菌种资源,同时表明菌落PCR结合DGGE技术为细菌鉴定和菌种保藏过程中重复菌株的去除提供了一种快速可靠的手段.5.学位论文陈接锋产聚β-羟基丁酸球衣菌分离筛选及发酵和提取的研究2003球衣菌是活性污泥中的主要丝状菌,对污水中的有机物和有毒物质有很强的降解能力,而且胞内也能积累相当量的PHB,已逐渐受到重视,因此,该文详细报道了球衣菌的研究概况,并以该菌合成PHB为研究方向,开展了系统的基础研究,主要包括以下工作: 1.通过富集培养和划线分离,结合初筛和复筛等手段,成功地从活性污泥中分离到一株高产PHB球衣菌(Sphaerotilus natans). 2.根据伯杰细菌鉴定手册,从细胞形态和结构、培养特征和生理生化特征等方面对菌种进行了鉴定,并对菌种保藏方法进行了初步研究. 3.对菌株产PHB发酵进行了优化研究,初步确定了最佳发酵培养基和发酵条件. 4.采用不同方法对球衣菌胞内PHB提取进行了研究,初步确定了最佳提取方法. 5.对提取获得的PHB样品采用紫外吸收光谱(UV)、红外光谱(IR)、元素分析、核磁共振(NMR)和气相色谱(GC)等手段进行了定性和定量分析. 以上研究成果将为今后开发利用球衣菌净化污水以及发酵生产PHB提供理论依据.6.期刊论文姚粟.程池.李金霞.胡海蓉.Yao Su.Cheng Chi.Li Jinxia.Hu Hairong Biolog微生物自动分析系统——丝状真菌鉴定操作规程的研究-食品与发酵工业2006,32(8)-Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统,目前我国已有多家科研单位、高校和生物企业引进该鉴定系统,但多用于细菌鉴定,应用于丝状真菌鉴定的研究未见报道.该系统用于丝状真菌鉴定是以微生物对95种碳源利用的特异性和利用碳源增殖后产生的浊度变化为基础.文中基于Biolog丝状真菌鉴定的验证实验,参考Biolog系统操作手册和国家微生物资源平台技术规程的统一格式,研究制定了丝状真菌鉴定操作规程,有利于提高Biolog鉴定系统鉴定丝状真菌的应用水平.7.期刊论文李文茹.谢小保.施庆珊.欧阳友生.陈仪本.LI Wen-ru.XIE Xiao-bao.SHI Qing-shan.OUYANG You-sheng.CHEN Yi-ben酱油中微生物及防腐体系的效能研究-中国调味品2009(9)从微生物的分离鉴定、挑战实验和抗二次污染方面对广东省某调味品厂生产的酱油防腐体系的效能进行了研究.采用平板培养法进行微生物分离和计数,未分离出真菌,分离的细菌数达到49 cfu/mL.对其中的4株细菌进行了生理生化特性研究和16S rRNA基因序列分析,其中1株细菌鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),1株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),另2株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).在对酱油防腐体系进行的挑战试验和抗二次污染试验中,发现酱油中的微生物数量逐渐减少.综合结果分析表明,添加了防腐剂的酱油具有较强的抑菌效果,其防腐体系能够满足食品卫生要求.8.学位论文刘勇常见细菌感染的芯片诊断系统的构建2004背景及目的:细菌感染是临床的重要问题,早期诊断和治疗具有重要的意义.延迟诊断导致盲目应用抗生素,增加经济负担,促进耐药的发生.培养法是目前细菌感染诊断的金标准,但费时长,且根据生化反应等表征来诊断,易误诊.也不易作为监测新发感染的工具.DNA芯片技术,作为一种大规模集成的固相杂交技术可能成为细菌感染检测的重要方法.目前的芯片杂交技术面临的一些问题为结果重复性差,非特异性信号强及探针设计结果不可预测性,靶细菌为实验室扩增后的标准菌株,而非临床菌株.采用的荧光显色法需要昂贵的试验仪器,临床不易推广等.该文采用不对称PCR,酶显色等技术建立了一种检测细菌感染的芯片系统,不仅能够快速灵敏的检测靶细菌感染,而且重复性好,信号强及不易出现非特异信号,有可能在临床得到广泛应用.方法:大肠埃希氏菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌,表面葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽寡食单胞菌等的标准菌株由该院感染菌种保藏中心提供.取各菌株转接于LB培养基中,于35℃摇床过夜.以自配的Chelex 100细菌DNA提取液抽取各菌种的DNA后于-20℃下保存.根据生物信息学技术设计以16S rRNA序列为靶基因设计各细菌的特异型探针和引物.待测细菌经cy5标记后的引物以不对称PCR方法扩增后,与固定探针的芯片进行杂交.然后在荧光扫描仪扫描,判定细菌的种类.并与测序结果和培养结果进行比较.以确定此方法的准确性.同时也建立了芯片的酶显色法,具有类似的敏感性.将其中一菌株系列稀释后再杂交以测定芯片的敏感度.结果:建立了针对16S rRNA序列的基因芯片检测系统,能够将大多数细菌鉴定到种.芯片的灵敏度(大肠杆菌)为20 fg/反应体系(相当于3到4个细菌),并且无明显的非特异性信号.结论:用该文建立的DNA芯片来检测细菌感染具有快速、高特异性和高灵敏度,且经济,具有临床可推广性,具有重要的临床价值.本文链接：/Periodical_zhonggsyzz200903015.aspx下载时间：2010年4月11日。