SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量
一、实验目的：
1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

二、实验原理：
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。

1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

三、仪器、原料和试剂
1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。

2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。

可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

3、试剂：
（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g 及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。

（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

（5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（6）1%TEMED；
（7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。

（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。

（9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。

用来溶解标准蛋白质及待测固体。

（10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL 冰乙酸即可。

（11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。

四、实验步骤
1．安装夹心式垂直板电泳槽：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。

2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。

本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。

3．制备凝胶板：
（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。

约30min后，凝胶与水
封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。

倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 5%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。

约30min后凝胶聚合，再放置
20—30min。

待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。

4．样品处理及加样
各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。

处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。

一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。

如样品较稀，可增加加样体积。

用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

5．电泳
将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。

待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。

当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。

拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

6．染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。

五、计算
电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：
1gMr =ad e/d0 +b
式中：Mr为蛋白质的分子量；a、b为常数；b为斜率；
相对迁移率m R =样品迁移距离d e（cm）/染料迁移距离d0（cm）
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。

六、思考题：
1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？
2、做好本实验的关键是什么？
3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时为什么要在样品中加少许溴酚兰？
4、是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？。