启动子 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上 看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用 的启动子。 终止子 转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用，即控 制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下 降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低 本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模 版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵 子的T1T2串连转录终止子 。 核糖体结合位点 启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与 rRNA16S亚基3‘端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多 数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有 。
1、基因的克隆 2、转化 3、表达 转基因植物表达系统的分类 1、稳定的整合表达系统 2、瞬时表达系统 3、叶绿体转化植物
转基因植物表达重组蛋白的优点
• 具有直接使用可食性植物原料的可能性 • 植物是一个能进行大规模生产的廉价生产系统， 在获得稳定遗传的转基因植株后，扩大耕种面积 就能提高蛋白的产量，随着种植面积的增加，产 量可按比例快速增加。 • 植物具有完整的真核细胞表达系统，可加工多聚 体蛋白 • 因为植物不充当人类病原体的宿主，因此更具安 全性
研究现状
• ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向 生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表 达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、 凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、 人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品 已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平 有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交 瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24 小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重 组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。
转基因植物表达系统
• 自从20世纪80年代初利用植物基因工程技术获得 转基因植物以来，植物生物技术得到了快速发展。 伴随着植物生物技术发展，植物体作为生物反应 器正在成为外源基因表达的重要体系，利用植物 外源重组蛋白生成药用蛋白或疫苗是转基因植物 研究的一个焦点。
转基因植物表达重组蛋白的一般步骤
• 转基因动物是指将特定的外源基因导全动物受 精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因 组并能遗传给后代的一类动物。 • 转基因动物所有的细胞均整合有外源基因， 并具有将外源基因遗传给子代的能力，若动物只 有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体 动物，这类动物只有在整合了外源基因的“部分 组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外 源基因遗传给子代。
1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒 转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快 速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达 产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体 是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因 进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki 森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近 几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细 胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生 物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是 否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型 载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载 体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达 的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用 SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型 载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般 是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点 的影响，同时还可能会 改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。
表达载体 为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转 录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计 出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同 要求的目的基因的需要。 通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位 点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报 告基因等。
常用的酵母表达系统
• 酿酒酵母表达系统 • 甲醇营养性酵母表达系统 • 裂植酵母表达系统
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在酵母中表达外源基因的步骤 1、外源基因克隆 2、转化酵母菌 3、筛选并鉴定转化子 4、外源蛋白的诱导表达
昆虫细胞表达系统
• 概念：昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分 推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中 多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很 多真核目的的基因得到有效甚至高水平的表达。 BEVS应用于外源蛋白表达的主要优点是：它具有 真核表达系统的翻译后加工能力，如二硫键的形 成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功 能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细 胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因； 具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外援 金银的能力；对脊椎动物是安全的。
转基因动物表达系统的优缺点
• 1．转基因动物成功率低 阳性率结果重复性差，甚至无法 重复，转基因动物的成功率较低。随后的研究虽然使成功 率有所提高，但总的成功率还是较低，限制了其应用的发 展。建立更完善的转基因方法。使用大的外源DNA片段。 2．造成宿主基因突变问题 外源基因在动物基因组中的随 机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变 及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处 于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动 物不育或死亡。基因打靶技术（gene targeting）能够使 目的基因定点整合，因此避免了对宿主基因的损伤，提高 了阳性率。 3．外源基因表达水平不高 转入的外源目的基 因在转基因动物中是否高效表达是转基因动物研究成败的 关键。对外源基因的整合机理进行深入研究。选择表达效 率高的启动子。
杆状病毒表达载体的构建方法
• 将目的基因克隆到合适的载体，置于杆状病毒启 动子控制之下。 • 用重组的转移载体和相应的野生型或改造过的野 生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞。 • 筛选重组病毒。 • 扩增病毒以进行大规模的蛋白生产。 • 纯化表达的外源蛋白。
哺乳动物细胞表达系统
• 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、 酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统 相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质 的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化 等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化 特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分 子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30 余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程 药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能 研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其 两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍 哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。
酵母表达系统
• 酵母是一类低等的单细胞真核生物，作为一种外源基因的 表达系统相对于其他表达系统的优势在于，它既具有真核 细胞的特性又具有类似于原核细胞的生长特点。 • 酵母系统包括多种细胞因子、多肽激素等。 • 酵母系统表达外源基因的优点在于原核表达系统相比酵母 是真核生物，可对表达的蛋白进行修饰，有利于保持生物 产品的活性和稳定性；而且可将表达系统的产物分泌到胞 外不仅有利于产品的纯化，还避免地表达系统的过度积累 对宿主产生不利影响；而对哺乳动物细胞表达系统相比酵 母更易于培养，可进行大规模的发酵生产，故在表达外源 蛋白，特别是大分子真核生物蛋白方面得到了广泛的应用。
原核表达系统的优缺点
优点：其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成 本相对比较低廉。 缺点：原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达 系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能 会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋 白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译 后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低 。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域， 其优点是 ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶 DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或 抑制 ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及； ③能严格 调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因 表达量 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前， 基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统 和哺乳动物细胞表达系统。
酵表达系统载体
• 酵母表达系统的载体一般用穿梭载体，穿梭载体 可以在酵母和大肠杆菌中进行复制，它是由酵母 野生型质粒、抗性基因、宿主染色体DNA上自主 复制序列（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒 序列（TEL）等组成的。 • 酵母中用于表达外源基因的常用表达载体一般可 以分为两种，即整合体型表达载体和附加体型表 达载体。
第二节 重组蛋白表达系统
一、原核表达系统