土壤微生物的分离纯化与鉴定一、实验目的1、通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。

8、根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌。

2、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

4、巩固练习显微镜使用方法。

5、明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。

6、学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；7、学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；二、基本原理1、培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。

但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。

不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 )。

所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。

此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

2、微生物的分离与纯化自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。

本实验将采用平板划线分离法。

3、分离菌株的鉴定微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。

不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。

不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。

所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础。

另一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。

三．实验仪器及材料1、培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分培养基；几丁质酶划线培养基；固体PDA斜面培养基；固体斜面培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水养基2、试剂及材料：土样、草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3、仪器：锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布、水浴锅、分光光度计等四、实验步骤Ⅰ.细菌的筛选，分离纯化及鉴定1.细菌的筛选（1）土样处理①配制生理盐水：在烧杯中配置200ml 0.85％的生理盐水，用移液管各移取9ml 于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；②加土样：冷却后u准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀30min，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。

（2）果胶酶菌种筛选①梯度稀释：无菌操作用无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液；②涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，在平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；③培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；④果胶酶透明圈平板检测：取培养后的涂布平皿，先观察并记录细菌形态，再用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色30分钟。

若观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；若无，则选择三个典型菌种进行观察。

⑤菌落描述：对所选定的菌种进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化（1）划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种（若无，则选择三个典型菌种），第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。

操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；（2）纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定3、细菌的基本形态及运动性鉴定（1）纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上（注意：点种的量不宜过多，以3～4个为宜），在30℃培养箱中培养1～2天，取培养后的平皿用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈的大小（2）简单染色步骤①涂片取一块载玻片，用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）②干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；③染色将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min ④水洗倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗载玻片背面，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；⑤干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；⑥镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

（3）革兰氏染色步骤①涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧三个区域的位置分别滴加半滴无菌水。

分别取三种菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，和待鉴定菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对三种菌进行干燥和固定。

共需鉴定3中典型菌种，每一种均按上述方法制片。

②初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；③媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；④脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；⑤复染先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗；⑥镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。

分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断三种典型菌种的染色结果。

（4）芽孢染色步骤①涂片，加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种三种典型菌种。

然后按照常规方法加热干燥及固定；②孔雀绿加热染色用试管夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；③水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。

具体水洗按常规方法进行；④复染用0.5%番红水溶液复染2min；⑤水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；⑥镜检先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。

（5）半固体穿刺法观察细菌运动性①配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于9支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；②在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。

如图所示：共接种三种典型菌，每种菌接种三支③接种完成后贴好标签在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

4.细菌的生理生化试验（1）淀粉水解试验①培养基制备配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50℃左右，无菌操作制成平板；②接种用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的三种菌在不同位置点种，另一区域作为空白对照。

（注：由于三种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式。

接种完成后贴好标签；将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时。

（2）葡萄糖发酵试验①培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于10试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。

②接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。

取盛有葡萄糖发酵培养基的试管9支，接种选定的三种典型菌，每种接种三只，另一支作为空白对照。

③培养将上述已接种的试管标号后置于30℃培养箱中培养48小时。

（3）乳糖发酵试验①培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于10试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。