PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
引物设计 酶切位点 分析
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
自动搜索 引物
手动编辑 引物
PCR-RFLP基因分型方法
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前引物的位置（必 须超过突变位点）
后引物的位置 （必须在突变位
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
突变位点，找不 到合适的内切酶
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Hinf I 可以使用PCR-RFLP的
方法基因分型
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
基本原则：
人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的 合适的酶切位点
引物设计
引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
基本原则：
1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
需要考虑的因素：
引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition）
PCR-RFLP:
是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技 术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再 选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳， 可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型 的目的。
PCR-RFLP基因分型方法
概念
PCR-RFLP基因分型方法
几种特殊类型的引物设计
引入酶切位点引物设计 Takara定点诱变试剂盒 定诱变引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
为什么要引入酶切位点？
突变位点没有内切酶 或者合适的内切酶
通过人为的在引物上改变一个碱基从而使 之与突变位点的碱基构成新的酶切位点
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
工欲善其事，必先利其器
Primer Premier 5.0 引物设计
Oligo 6.0 引物评价
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
新建窗口
输入序列
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突变位点
选取突变位点 前后约500bp 长度的碱基
概念
Step by step
电
选择内切酶
设计引物
确定基因序列
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基因型 泳
基因序列查找
PCR-RFLP基因分型方法
PCR-RFLP基因分型方法
基因序列查找
选择 gene
输入基因名 称
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基因序列查找
基因的全称
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基因的物 种来源
PCR-RFLP 基因分型方法
---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析
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概念
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP):
是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp
太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度
引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，
引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ， 5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。
点之后）
PCR产物 的长度
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引物的长度
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引物的综合评分， 分越高引物越好
引物序列
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引物的详细信息
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发夹结构 二聚体 错配
交叉二 聚体
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引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜
两条引物之间的GC含量不宜相差太大
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引物一般原则
Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最
好相差不要大于5 度
引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5
最好不要位于3’末端
否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的 影响了
ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的
ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而 3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发
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PCR-RFLP 引物特殊要求
PCR产物的长度：200-1000bp 酶切后产物片断的大小差距：100bp以上
更高级应用：
参数的设置 手动搜索或者修改引物 搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）
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引物纯化方式的选择
去盐（ RPC 、Desalted）纯化 它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除 盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、 DNA测序等实验。 PAGE纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE 纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化 后的纯度 大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。 适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需用引物， 各种探针等。 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。 适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、 长链DNA、PCR克隆，PC定R-RF点LP基因突分型变方法，人工合成基因等。