2.00 — 1.00 5滴
• 摇匀 (此后再勿摇动!!)，注意观察各管之颜色变化，并记录各 管颜色消退的顺序和时间，并分析之。 •将退色的反应液震荡，观察实验现象并分析产生该现象的原因。
离心操作注意事项
1．精密平衡 2．对称放臵 3．锁定盖子 4．限速运转
– 确认所用转子最大额定速度，离心机不能超过最大额
定速度的75%。
5．停转开盖 6．选择合适的离心管和转子
– 一般离心管是特制聚乙烯管，不能用玻璃管代替离心
管。 – 液体不能装得过多，以防离心时甩出，造成转头生锈 或被腐蚀。
实验目的
(1)固定角度转子(fixed-angle rotor)；
(2)水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)； (3)垂直转子(vertical rotor)。


转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。
钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，比较笨重，但 它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化 学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。
实验四 酶的竞争性抑制
三峡大学医学院生物化学教研室

问题1：本次实验提取的是什么酶？

问题2：该酶位于细胞的什么部位？催化 什么化学反应？

琥珀酸脱氢生成延胡索酸:
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
H CH COOH H CH COOH
琥珀酸 (succinate)
HOOC CH HC COOH
延胡索酸 (fumarate)

学习动物的处死方法 学习动物组织匀浆法


学习离心机的使用方法
了解琥珀酸脱氢酶的作用，进一步理 解酶的竞争性抑制原理
酶竞争性抑制实验所需试剂
1、pH7.4磷酸缓冲液 2、0.25％琥珀酸钠溶液 3、0.5％草酸钠溶液 4、0.01％甲烯兰溶液
小鼠的抓取保定
小鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。 抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部（如图 11-3所示）放在格板或铁笼上。 趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小 鼠的尾巴根部握入手掌（如图11-4所示）； 放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食 指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠（如图 11-5所示），完成抓取保定。
相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2
R为离心转子的半径（cm），N为转速（转/分） 低速离心常以rpm表示 超速离心以×g表示。


离心机的分类

目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多， 按其离心转子所能达到的最高转速分为：

颈椎脱臼处死法处死小鼠
将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死， 为大、小鼠最常用的处死方法。 操作时用左手拇指、食指用力向下按压鼠 头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后 上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离， 实验动物立即死亡。

•注意: • 实验人员的安全； • 确认实验动物已经死亡； • 妥善处理好尸体。
2、另取中试管五支，标号，按下表操作(单位为ml)：
试 剂
0.25％琥珀酸钠液
1号管
0.50
2号管
—
3号管
0.50
4号管
2.00
5号管
0.50
0.5％草酸钠液 蒸馏水 肝糜液 甲烯蓝
— 2.00 1.00 5滴
0.50 2.00 1.00 5滴
0.50 1.50 1.00 5滴
0.50 — 1.00 5滴

问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？
• 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。
• 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受 琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。
•蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。

问题4：何为竞争性抑制？

问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？
问题6：如何设计实验方案检测酶被抑制的 程度？


竞争性抑制：分子结构与底物相似的抑制剂 与底物竞争结合酶的活性中心，抑制酶活性。
EI不能转变成产物 Ki：EI的解离常数，抑制常数

草酸、丙二酸与琥珀酸分子结构相似，是琥 珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
COO COO Oxalate

酶被抑制的程度取决于抑制剂与酶的亲和力 及与底物的相对比例。 可依据蓝色消褪的时间判断酶活性被抑制的 程度。
– 低速离心机(在6,000rpm以下) – 高速离心机(在25,000rpm以下) – 超速离心机(在30,000rpm以上)

目前商售大型超速离心机最高转速达100,000rpm， 相对离心力达803,000×g。
低速离心机
台式高速冷冻离心机
超速冷冻离心机
离心机转子

常用的离心机转子有三种：

离心机转子从静止状态加速旋转
– 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向
移动，即发生沉降；
– 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向
移动，即发生漂浮。

在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、 浮力FB和摩擦阻力Ff。
离心力

转速（revolutions per minute ，rpm）
肝脏
组织匀浆法
匀浆的方式 –手工匀浆
–机器匀浆：组织捣碎匀浆器
–超声匀浆：超声粉碎机
–反复冻融
实验步骤
1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏 全部取出（为何选肝脏？），臵于研钵中，用生理 盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入 少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几 次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜 上）。 研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。 将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸 脱氢酶的肝糜液。
ห้องสมุดไป่ตู้
•The effect of a competitive inhibitor can be overcome with high concentrations of the substrate
离心技术

利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使臵于旋 转体（离心机）中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从 而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。