一、大肠杆菌的培养和分离
用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。
__________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较
__________分离法---方法简单；
__________分离法—单菌落易分离，操作复杂
3.灭菌操作
①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的
②各种培养基必须是无菌
4.培养和分离步骤
__________→__________→__________培养__________分离→培养保存
5.灭菌与消毒
二、分离以尿素为唯一氮源的微生物
1.实验原理
（1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2
（2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________
2实验步骤
制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存
注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上
3预测结果：
①LB全素固体培养基上__________；
②以尿素为唯一氮源固体培养基__________；
③一定时间内，菌落周围出现__________区域；
④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。
高考及高考模拟题
1.（16年10月32T）回答下列（一）（二）小题
（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题
（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加，灭菌备用。
（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗，故用于过滤细菌。
然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。
（3）取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是（A. 10-5稀释液+尿素固体培养基 B. 10-5稀释液+LB固体培养基 C. 10-4稀释液+尿素固体培养基 D. 10-4稀释液+LB固体培养基）。
在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。
（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。
再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是。
答案：（一）（1）琼脂（2）高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过（3）A 红色环氨（或NH3）（4）除去游离的脲酶
2.（17届选择题3月32T）（一）生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。
请回答
下列问题：
（1）培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用法灭菌。
检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用进行一系列的梯度稀释。
（2）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀到LB固体培养基，于恒温培养箱，在℃条件进行培养。
用该方法统计样本菌落数时（填需
要或不需要）设置对照组。
（3）下图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_________。
A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B．步骤②接种环火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后划线
C．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤④恒温培养箱培养后可用来对大肠杆菌进行计数
答案：（1）高压蒸汽灭菌无菌水（2）涂布倒置37 需要（3）C
3.（金华市17年1月期末32T）(1)在“分离以尿素为氮源的微生物”的实验中，配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用方法灭菌，冷却后加入用G6玻璃纱漏斗过滤的尿素溶液。
玻璃纱漏斗角后需用适宜浓度的浸泡，再用冲洗，干燥后保存。
答案：高压蒸汽灭菌 HCl 蒸馏水
4.（湖州市17年1月32T）(一）随着社会的发展，石油产品的使用越来越多，石油烃污染也越来越严重。
为了筛选出分解石油烃能力强的微生物，人们不断地进行研究。
下图为获取能分离出分解石油烃的微生物的土壤样品后的研究过程，请回答有关问题：
(1)获取土壤样品的取样地点最好选在。
为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程①④所用的选择培养基只能以石油烃作为唯一碳源，其原因是。
(2)根据⑤平板上生长的菌落，对④进行接种采用的方法是 ,若发现在⑤中无法区分菌落，可以将图中③取出的菌液。
(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是。
采用方法对其进行灭菌。
划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。
造成划线无菌落可能的操作失误是
(写出一点即可)。
答案：（1）石油烃污染明显处只有能利用石油烃的微生物能正常生长繁殖（2）涂布分离进行（梯度）稀释
（3）接种环灼烧接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始划线
5.（浙江省17届模拟卷二32T）(一）脲酶是催化尿素分解的特异性水解酶。
该酶主要从刀豆等豆科植物提取，现被广泛应用于尿素废水的净化过程。
请分析回答以下问题：
(1)脲酶可以催化尿素分解为，其中碱性物质可以能使酌红指示剂变为。
(2)为了提高脲酶的利用效率，可以釆用固定化酶技术将其固定。
酶的固定化方法有：吸附法、共价偶联法、包埋法和。
(3)实验室中可以采用吸附法将该酶制成固定化酶柱，让尿素废水过柱前，先用10倍体积的蒸馏水洗涤酶柱，目的是。
(4)脲酶除了从植物获取外，还可以来源于土壤中的微生物。
为了从土壤中分离得到队尿素为氮源的微生物,采用的分离方法操作最简便的是。
下列有关该分离方法的操作叙述错误的是。
A.必须使用固体培养基
B.必须在酒精灯火焰旁接种
C.必须将接种后的培养皿倒置培养
D.必须将接种前的培养皿、培养基、土壤悬浮液等进行灭菌处理
答案：(1)NH3和CO2（1分，顺序可对换，错答或漏答不得分）红色（1分）
(2)交联法（1分）（3)除去未吸附的游离尿酶（1分）(4)划线分离法（1分） D(2分）6.（超级全能王16年12月联考32T）(一)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。
下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程。
(1)在步骤①中，用稀释制成不同浓度的样品悬液。
(2)步骤②中将保存在70%酒精中的放在酒精灯火焰上，待火焰熄灭，将菌液涂布到整个平面，将培养皿在37°C恒温培养箱中培养24〜48小时，观察菌落数。
(3)步骤③应选择挑取涂布平板上长出的，再通过划线进一步。
(4)步骤④中，将菌种接种在培养基中，在37°C恒温培养箱中培养24h后，置于冰箱中保存。
(5)若该漆酶大量应用于环境修复，可先用石英砂对漆酶进行 (A.包埋B.共价偶联
C.吸附
D.交联)法固定，再进行工业化使用。
答案：（1)无菌水(2)玻璃刮刀倒置(3)单菌落纯化(4)斜面 4°C (5)C
7.（宁波市17年8月32T）（一）下表是用于从土壤中分离纯化细菌的培养基配方。
请回答：
（1）培养基的类型很多，按照“细菌喜▲，霉菌喜▲”的原则配制上述培养基后，一般还要调节 pH 并对培养基进行▲处理。
（2）分离纯化微生物最常使用的划线分离法中，接种环在菌液中蘸菌液▲（A．一 B．二C．三 D．四）次；若用涂布分离法，则制备细菌悬液时，一般需进行▲处理，为确保操作过程不被杂菌污染，接种必须在▲附近操作。
（3）假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举一项) ▲。
答案：（1）荤素高压蒸汽灭菌（2）A 稀释酒精灯火焰（3）稀释倍数不够（第一次划线后没有灭菌接着第二次划线或培养过程中灭菌不严格受到微生物污染）。