生命科学系2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3)实验二质粒DNA的转化 (4)实验三质粒DNA的提取 (5)实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7)实验五PCR基因扩增 (9)实验六DNA重组 (10)实验七蓝白斑筛选实验 (11)实验八DNA酶切技术 (13)实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。
我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。
因而具备了吸收外源DNA的能力。
三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂：1.大肠杆菌top10菌株2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL3..LB液体及固体培养基4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤：1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。
2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600应在0.4～0.5之间)3.将菌液置冰浴中10min。
（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷）4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。
5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。
6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
实验二质粒DNA的转化一、实验目的：掌握质粒DNA的转化技术二、实验原理: DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。
转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Amp r）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。
三、仪器：1.超净工作台 2. 恒温摇床 3.恒温水浴四、1.材料与试剂：LB培养基（液体、固体平板）2.感受态3.无菌水五、实验操作步骤：1.200µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。
同时做一对照试验：200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全一样。
2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。
3.冰浴2min。
4.复苏：管中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）5.涂平板：取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。
待大约30min，让菌液被培养基吸收。
6.菌落培养：倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。
照相。
实验三质粒DNA的提取一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法二、实验原理碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
三、仪器、材料与试剂(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．漩涡混合器(二)材料与试剂材料：带有pGEM-T质粒的大肠杆菌试剂：1. Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)]2.. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合）3. Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL)4. TE缓冲液 (PH8.0)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)]5. 0.5mo1／L (EDTA)6. 氯仿：异戊醇（24：1）7. Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）8. RTE (含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液)四、实验步骤1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜；2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量；3.在离心管中加入100µL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min；4.加入200µL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）；5.加入150µL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。
在冰上静置15min 让质粒DNA复性；6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中；7.向上清中加入等体积（约450µL）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）；8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）；9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。
12000r/min 离心10min，弃上清；10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。
将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净；11.加20µLRTE(含有RnaseA20µg/mL的TE缓冲液)，使质粒溶解，-20℃保存。
实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术与方法二、实验原理：DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA 几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子（以质粒为例，一般情况下迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环）。
三、仪器、材料与试剂(一)仪器1.琼脂糖凝胶电泳系统2. 凝胶成像系统(二)材料与试剂材料：1.pGEM-T质粒DNA（含PODa基因3’片段）（是实验三的回收产物）2.琼脂糖3.ＥＢ（溴化乙锭）试剂：1.5×TBE2.6×loading-buffer(加样缓冲液)四、实验步骤1.制备1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20mL0.5×TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全融化，取出摇匀，室温下降温至60℃左右，开始制胶板；2.胶版制备：将有机玻璃内槽洗净晾干，放置一水平制胶器中，并放好样品梳子，待凝胶放凉至60℃左右时，缓缓倒入有机玻璃内槽（注意，不要形成气泡）即成胶板，室温下凝固约30min，将有机玻璃内槽放入电泳槽内（注意方向：加样孔远离电泳槽的正极端）。
3.加电泳液：将0.5×TBE缓冲液加入电泳槽内，刚好淹没凝胶平面，轻轻拔出梳子。
4.加样：取DNA 2µL+DDH2O3µL+6×loading-buffer1µL，混匀后用移液枪加入加样孔。
记录加样的顺序。
通常第一泳道加样为DNA Mark。
5.电泳：电压一般不超过5V/cm，注意电极的方向不能错了，DNA向正极移动。
当溴酚蓝移动到凝胶前沿约2cm时，停止电泳，切断电源。
6.染色、照相：戴上手套，将凝胶移入盛有0.5µg/mL EB的染色盘中，染色5min，在移入蒸馏水中漂洗5～10min，洗掉多余的燃料，然后转入凝胶成像系统照相。
操作中谨防EB污染。
五、试验结果注意观察DNA的分子量大小，估计DNA的含量，推测出样品DNA的浓度，观察质粒的3种构型，分析质粒DNA的质量，判断可否作为下一步基因重组的材料？实验五 PCR基因扩增一、实验目的：掌握PCR反应的基本原理和实验技术二、实验原理：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控等许多方面。
三、仪器、材料与试剂：1.PCR仪；凝胶电泳及凝胶成像系统；Taq酶及其Buffer；PCR管2. PCR反应成分：①.模板DNA：实验三提取的质粒DNA（含Poda3’） 2ul (浓度高的稀释5倍后)②.引物: poda3’P1 (10umol) 1ul③.引物： poda3’P2 (10umol) 1ul④.dNTP：（each 2.5mmol） 4ul⑤.反应缓冲液： 10×plus Buffer 5ul⑥.DNA聚合酶： Taq plus Polymerase 2ul⑦.DD H2O 35ul四、PCR反应基本步骤：①.94℃预变性 5min；②.94℃变性 40S；③.61℃退火40S；④.72℃延伸 60S;⑤.重复②～④步35次；⑥72℃延伸5min；⑦4℃保存4min；⑧end。