蝴蝶兰组织培养技术研究一、实验目的1.能够正确选取外植体，并最其进行前处理2.能够有效防止外植体褐变的发生。

3.能够正确进行继代培养与壮苗正根培养。

4.能够利用无菌播种方式进行种子繁殖。

5.培养团队精神、责任心和科学的思维能力。

二、实验原理随着植物组织培养技术在植物快繁上的应用，近年来，对蝴蝶兰组织培养研究较多的是用胚、幼叶、茎尖和根尖、花梗腋芽等多种器官为外植体进行组织培养研究，由于所选外植体材料各异，难度也有高低，虽然有些技术已经用于大规模工厂化生产，但仍面临一些困难，有待于进一步探索和完善。

根据目前蝴蝶兰的发展状况，本文将在以花梗侧芽、茎尖、叶片为外植体材料进行组织快繁技术上作深入的探讨和研究。

三、实验仪器及试剂花梗腋芽诱导培养基为1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L增殖培养基为1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1.0 mg/L + NAA0.5 mg/L + 椰乳10 %。

生根培养基为1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥诱导培养基为1/3MS+NAA0.5~1.0毫克/升+6-BA3.0~5.0毫克/升+椰乳15%+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，或KC+NAA1.0毫克/升+6-BA5.0毫克/升+椰乳15%+蔗糖20克/升+琼脂6克/升柠檬酸300毫克/升以上培养基p H 均为5.6四、实验步骤与方法（一）花梗腋芽和顶芽组织培养快速繁殖技术蝴蝶兰为总状花序，通常由花梗基部算起在第4或至第7节才会分化花朵。

除最基部一节外，剥开位于该节位以上各节的苞片都可看到腋芽，近顶端的节含有未完全分化的花原始体，花轴基部的芽往往为休眠芽，常具有苞片覆盖，连同花序的顶端，都是花梗腋芽组织培养的好材料。

1．花梗腋芽的培养途径对花梗腋芽有两条培养途径，一是切取带腋芽的花梗茎段培养；二是不带花梗组织剥取茎尖生长点培养。

其中采用腋芽茎段培养，促使休眠芽启动向营养芽转化，尔后采用丛生芽方式直接增殖，从而不通过脱分化形成原球茎阶段，可以减少变异，保持母株优良特性，但增殖速度相对后者较慢。

2.外植体取材、消毒和接种2.1 操作程序2.1.1 从蝴蝶兰出现花梗到花朵凋谢，在花梗尚未枯黄前，都可用来作为外植体。

剪下来的花梗，用75%乙醇的棉化球将花梗外表的灰尘、杂物等擦拭干净，然后以节为单位切成段，含芽的花梗时上下留不同长度，置于超净工作台上，准备消毒。

2.1.2 将花梗腋芽上的的苞叶去除，并用解剖刀把节与芽相接处清除干净。

另外，若在花梗表面有病斑或焦枯的部分，应以解剖刀削去。

2.1.3 一般花朵盛开或已凋谢的成熟花梗，在0.1%HgCl2-吐温80溶液中消毒10~15分；如果是较嫩的组织，消毒时间缩短为8~10分钟。

2.1.4 消毒时间到时，材料取出置于盛有无菌水烧杯中，无菌水荡洗3~5次。

2.1.5 将冲洗后的外植体置于无菌的培养皿中，用锐利的解剖刀截去两端与消毒液接触部分，取出中间部分插入诱导培养基中。

花梗初次接种于诱导培养基上，附加不同浓度的BA、NAA、胰蛋白胨或椰乳能提高诱导率。

另外添加柠檬酸300毫克/升防止褐变，调节PH至5.6，通常可以获得满意效果。

诱导蝴蝶兰侧芽萌动的影响因素，主要集中在培养温度，腋芽节位和激素浓度等方面。

蝴蝶兰花梗诱导培养操作时，培养室温度为25±1℃，光照强度1500勒，每天光照10~16个小时。

通常花梗侧芽在适当培养基上培养7~10天后，腋芽突出肥大，经过15天后，腋芽萌发，可达1厘米以上不定芽。

细胞分裂素BA有利于营养芽萌发，在28℃培养条件下，诱导率随BA浓度升高而提高，其中添加5毫克/升BA，花梗各部位的腋芽绝大多数发育为营养芽。

此外，生长素的存在对腋芽诱导也有显著促进作用。

蝴蝶兰花梗腋芽诱导丛生芽的较好培养条件是在25℃~28℃进行光照培养，光照度为1500勒左右，培养基中添加1~3毫克/升BA和1.0毫克/升的NAA。

一般接种7天后，外植体萌动、膨大并向外伸长，30天后长出小叶，50天左右可长出4~5片叶。

而花序顶端小芽的启动较慢，40~50天后才见小叶萌发伸展。

当在试管内长成无菌植株，便于进一步利用，如取无菌试管苗的叶片、茎尖或根尖进行培养，建立无性繁殖体系。

4．继代培养将诱导产生的芽或芽丛从花梗上切离，转入继代增殖培养基上培养，一般每瓶接种6~10株无根苗。

培养条件与诱导相同，也可以将激素浓度和配比稍做调整，主要取决于不同品种而已。

一般可以适当调高细胞分裂素的浓度，降低或不用生长素，如仅添加6~BA3~5毫克/升。

影响蝴蝶兰丛生芽继代培养效果的条件和因素主要是生长调节剂种类和浓度、有机物添加种类等。

细胞分裂素有利于芽的增殖，在BA浓度1~20毫克/升范围内增殖率随BA浓度上升而增加，但是BA浓度过高会使芽的生长减弱。

另外，培养基中添加椰乳能明显提高蝴蝶兰丛生芽的增殖率，且长势较好，而其他有机物如水解乳蛋白（LH）、水解酪蛋白（CH）和酵母汁（YE）等有机添加物不能促进丛生芽增殖，反而有轻微抑制作用。

丛生芽增殖方式有两种：一种是将小芽切离花梗茎段，并横切为上下两段，分别接种培养，诱导丛生芽增殖；另一种是将芽切离茎段，作为种苗接种培养，30天左右在基部可萌发新的芽丛，40天后可分割丛生芽，按照苗的大小分级移植，由此通过不断分苗，不断获得种苗和丛生苗，达到扩大繁殖的目的。

丛生芽增殖周期较长，需要添加椰乳、水解胰蛋白等适宜的有机物。

5．壮苗和生根培养蝴蝶兰壮苗与生根一般同时进行，其基本培养基成分与继代所需相同，主要是对激素浓度和配比作些调整。

试验证明，同时降低BA和NAA浓度，可明显促进植株生长，但浓度过低又不利于生长，最佳浓度为BA1.0毫克/升、NAA0.1毫克/升，此时植株生长健壮，叶数可达3~4片，根长且粗壮。

在促进根系生长方面，适当提高光照浓度可明显促进植株生长健壮，其中以3000勒光强最好，表现出叶色浓绿、叶片肥厚、植株健壮；而在1000勒时，叶色浅绿、叶片瘦长、植株较弱。

在培养基中添加香蕉泥和马铃薯泥，可以明显促进根系生长，生根数量较多。

6．试管苗移栽和养护从瓶中取出试管苗，洗净根部琼脂，消毒后移植于温室塑料筛筐中培养。

培育基质以水苔为主，另加少量陶粒、蛭石，碎砖和树皮等颗粒硬材料。

2周后可使用花宝1号等优质花肥叶面喷施和灌根。

（二) 茎尖组织培养快繁技术1．茎尖获取与消毒接种1.1盆栽兰苗茎尖获取：由于蝴蝶兰的茎尖深藏于叶片夹缝中，分离和消毒很困难,因而直接从盆栽兰苗采取外植体进行培养的难度相对较高，成功率低，但这是为获得保留母株优良性状的组培苗时必需的。

成株蝴蝶兰从茎中部切断，剥除叶片。

用水冲洗，去掉顶部嫩叶。

在浓洗衣粉液中，用毛刷刷洗茎顶部叶片夹缝处，用自来水冲洗20分钟。

用刀修整茎尖后浸染入0.1%HgCl2-吐温80 溶液消毒5分钟,无菌水冲洗3次。

超净工作台上，于解剖显微镜下剥离不大于5立方毫米的茎尖，再次浸入含有效氯0.5%84消毒液中灭菌5~10分钟,无菌水冲洗3次,无菌滤纸吸干水分, 茎尖接种到诱导培养基上。

1.2 试管苗茎尖培养：蝴蝶兰茎尖培养常用的外植体是利用花梗腋芽萌发或种子发芽的无菌实生苗，切取其茎尖进行培养，诱导原球茎，其目的是通过原球茎方式能够快速的繁殖试管苗。

取茎尖的方法相似，一般需借助解剖镜，在无菌条件下，用手术刀切去试管苗的根、叶，小心剥取0.3~1.0毫米大小的茎尖，接种于诱导发生原球茎的培养基上。

2．茎尖诱导原球茎初代培养原球茎诱导成功与否受诸多因素影响，最主要的是培养基的种类、生长调节剂种类及浓度配比。

诱导培养基通常采用MS、VW和KC附加15%椰乳的固体培养基，添加BA5.0毫克/升或2，4-D0.1毫克/升。

附加活性炭0.25%常可提高诱导率。

在实际生产操作中，茎尖诱导培养基常需要依据不同品种而作调整，因为基本培养基、激素浓度及配比对不同的蝴蝶兰品种而言有所差异。

海南蝴蝶兰在KC培养基诱导的效果比较好，但不使用外源激素不能诱导茎尖产生原球茎；单独使用生长素NAA也不能产生原球茎；单独使用0.5~2.0毫克/升范围内的BA可诱导茎尖产生原球茎，但诱导率低；BA浓度达到5.0毫克/升或以上时，20天后茎尖开始褐化坏死，这可能是高浓度BA刺激多酚氧化酶活性提高，对培养物产生毒害作用。

NAA与BA配合使用诱导效果较好，以BA2.0毫克/升+NAA0.5毫克/升和BA4.0毫克/升+NAA0.5毫克/升配比最好，原球茎诱导率高。

茎尖接种到诱导培养基上，25℃恒温培养，1500~2000勒光照强度每天光照16~24小时。

2周后外植体膨大，少数较大的茎尖切块长出侧芽继而形成小叶片，随后在叶片上长出颗粒状的原球茎，另一部分体积较小的茎尖膨大后直接从周围长出原球茎。

可见大小适中的茎尖诱导形成的原球茎的速度较快。

3个月后，长成桑果状原球茎状体，组织块直径约6毫米，类似于愈伤组织，只是表面上布满了圆球状颗粒，用于继代培养。

3.继代增殖及生根壮苗培养参照原球茎继代增殖和生根壮苗的部分。

（三）叶片组织培养快速繁殖技术取叶片培养对蝴蝶兰母株伤害不大，也不受植株开花与否的限制，是较适合的培养途径。

与茎尖培养一样，蝴蝶兰的叶片培养也是通过诱导原球茎增殖方式实现快速繁殖的。

由花梗芽或由原球茎分化形成的叶片，或试管实生幼苗叶片不要经过表面消毒，诱导率很高，实际工作中多采用。

1．外植体的准备、接种兰株采用试管苗，最好以液体培养使叶片肥厚，然后切取叶片基部0.5~1.0厘米培养。

将切取的部位上表面朝上平放于培养基上，初期的一个月左右采用暗培养效果较好。

诱导形成愈伤组织状的原球茎状体，在固体培养基中增殖，或在液体培养基中增殖。

2．诱导培养我国也有许多学者对蝴蝶兰叶片组织培养进行了研究，各种培养基皆能成功，但诱导叶片产生原球茎的诱导率都不理想，一般低于20%。

影响叶片外植体诱导成功率的因素主要有叶片取材部位、培养基成分、激素种类和浓度、有机添加物和活性炭等。

2.1 培养基：最常用的是MS培养基。

虽然一些试验表明这些基本培养基的培养效果有一定的差异，但不是决定因素，主要表现出诱导率高低不同，而不是能不能成功。

2.2 激素种类和浓度：这是叶片原球茎诱导的关键影响因素，其中细胞分裂素BA是决定蝴蝶兰原球茎能否产生的重要因素。

杨美纯等研究发现在所有未添加BA的培养基上，不管添加何种果汁，均未能诱导出原球茎，而只有在添加了BA的培养基上才能形成原球茎，其中以MS附加5毫克/升BA的组合能获得较高的原球茎诱导率，又能使原球茎进一步生长发育正常。

同时还发现，加入果汁能明显提高原球茎诱导率，以在MS+BA5.0毫克/升培养基中加入椰乳的诱导率最高，达到42%~43%，而不加果汁的诱导率仅18%，而且每个外植体叶块上产生的原球茎颗粒既多又健壮。