统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室 中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配
3 基量。
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重氮化偶合比色测定法
• 具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化后，
可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色 偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较， 即可求得磺胺药的含量。
• 剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去
✓ 贮存标准液 取标准品0.125g溶于蒸馏水中，并稀 释至1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L 氢氧化钠25mL中，再加4mol/L硫酸175 mL，用 蒸馏水稀释至1000mL。
✓ 应用标准液 精确吸取贮存标准液3mL，置100 9 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至医刻学课度件pp。t
实验三 药物血浆蛋白结合率测定
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测定方法
平衡透析法 超过滤法 分配平衡法 稳定同位素-GC-MS法 凝胶过滤法 光谱技术
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平衡透析法
基本原理
将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室 与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半
透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到 平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系
➢ 取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋
酸4ml，混匀，静置2min，过滤
取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管
取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管
取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管
➢ 在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，
13 放置3min
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材料与试剂
➢ 药物 10%磺胺嘧啶钠注射液
➢ 试剂
• 15%三氯醋酸溶液
• 0.1%亚硝酸钠溶液
• 0.5%氨基磺酸胺溶液
• 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液
• 磺胺嘧啶钠贮存标准液
• 磺胺嘧啶钠应用标准液
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➢ 透析液 （PBS） pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液
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6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需60h左 右。
7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等 量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出。 如检查为阳性，则该样品作废。
8. 取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小
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心解开透析袋，使袋内血浆流入干净医学试课件管ppt。
9. 用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度
操作步骤
1. 血浆的制备：兔心脏采血（鸡翼静脉采血）， 肝素抗凝，以3000rpm离心10min，上清液即为 血浆。
2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结 扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水 平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎
10 紧口袋另一端。注意：袋口不得污染医血学课浆件pp。t
3. 将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的
30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面
4. 加2.0ml透析液代替血浆于半透膜袋内，作平 衡时间对照样品，以确定药物从袋内外自由扩 散达到平衡所需时间。
5. 加所试磺胺药溶液0.25ml于各瓶袋外透析液中。
注意：容积越小越好，以免影响透析液的组成
计算公式
游离磺胺药含量 （mg%）=
测定管光密度 标准管光密度
× 应用标准液浓度×样品稀释倍数
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计算公式
Dt Df
fb= Dt ×100%
fb：血浆蛋白结合率； Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）； Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）
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➢各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放
置2min
➢各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液
2.5mL，充分混匀，放置10min
➢用721分光光度计在550nm波长处比色
以空白管校正光密度到0点，读取标准管和
测定管光密度，计算游离磺胺药物含量
14 10. 计算血浆蛋白结合率
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➢ 鸡、兔各三只 ➢ 管状半透膜 周长5cm，长约12cm
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设备与器械
• 721分光光度计、离心机、天平 • 注射器、广口瓶、烧杯、三角烧瓶、试管、
试管架、漏斗、滤纸、丝线、注射器
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试剂的配制
✓ 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液( PBS) ： 贮存液： A液：0.2M Na2HPO4
Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液： 0.2M NaH2P4
NaH2P4·2H2O 12克，加蒸馏水至1000ml；
应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水
作10倍稀释即成。
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试剂的配制
✓ 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 0.5 g溶于 95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀释至500ml， 棕色瓶于冰箱中保存