（4)将混合物转入50mｌ(或分装入2个３０ml)离心管中，平衡后,用高速冷冻离心机离心，
4℃,１50０0rpm,15miｎ。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
（4）用移液器(或滴管)吸出上层有机相（弃掉）。
（５)用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积,并记录。
(6)取出2ｍl放入2ｍl离心管中（标记为粗级分Ｉ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
（4)取出2ml放入２ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ,－20℃下保存)，用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。(注:离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口,然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）
(五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现,可进行分析讨论。
材料及试剂
1.市售鲜啤酒酵母(低温保存）
2.石英砂（海沙)、甲苯（使用前预冷到0℃以下)
3.9５％乙醇（预冷-20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）
4.Tris－HCl(pＨ7.３）缓冲液
（四)操作步骤
１.提取
(1）将市售鲜啤酒酵母2000ｒpm，离心10min，除去大量水分。
(２)将研钵稳妥放入冰浴中。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用,才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理,乙醇沉淀,柱层析等步骤提取蔗糖酶,并对其性质进行测定。
３.乙醇沉淀
（1)将盛有热处理搅拌、放置，需1小时。
(2)转入清洁的离心管中,用４℃,150０0rpm，离心15min,倾去上清,并滴干。
（3)离心管中沉淀用５~8mlTｒis-ＨCl(pH7.3)缓冲液充分溶解（若溶液混浊,则用离心管，40０0rpm离心除去不溶物),转入量筒,量出体积，并记录。
１. 0.05mol/ＬTｒｉs-HCl缓冲液（pH7.3)
2．0.5mｏl/L NaOＨ
3．0.5moｌ／L HCl
4.含100mmol／LNａCl的０．0５mol／ＬTｒis-HCl（ｐH7.3）液
5．DEＡＥ-纤维素
6.２%蔗糖溶液
7.Bｅnｅdiｃt试剂:称取柠檬酸钠１73ｇ及碳酸钠（Nａ2CO3•H20)１00g加入600ｍＬ蒸馏水中，加热使其溶解,冷却,稀释８５0mL。另称取1７．3g硫酸铜溶解于1０0mL热蒸馏水中,冷却，稀释至1５0mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸-碳酸钠溶液中,边加边搅拌,混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
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酵母蔗糖酶的提取及性质测定
引论及原理
酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验,接近研究性实验,包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程;同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深,构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会,学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究。
2.热处理
(１)将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中,保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。
（2)取出小烧杯,迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，１５000rｐm，离心1５mｉｎ。
(3)将上清液转入量筒,量出体积,并记录。
（４）取出2ｍl放入2ml离心管中（标记为热级分II，－２0℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
蔗糖酶(iｎvertａse）(—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）(fruｃtｏｆｕrａnosｉdefruｃtohydrｏlasｅ)（EC.3.2．１.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解,生成密二糖和果糖。每水解1ｍol蔗糖，就生成2ｍｏｌ还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelｓon比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
（３)称取５０ｇ鲜啤酒酵母，加３0g石英砂放入研钵中,加５０ml预冷的甲苯（边研边加)或预冷的去离子水,在研钵内研磨成糊状,然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水,边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水,研磨约4０～60分钟,使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果,至酵母细胞大部分研碎)。
（四)操作步骤
1.离子交换剂的处理
(1)称取6克ＤEAE纤维素（ＤE-2３）干粉，加水浸24小时抽干(真空泵或抽滤瓶)后放入小烧杯中；
一、蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）实验目的
学习酶的提取和纯化方法,掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
(二）实验原理(略）
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、-20℃冰箱
2.电子天平、研钵（>20０ml）、制冰机、50ml烧杯
3.离心管（2mｌ，1０ml，30ml或5０ml)、移液器(10０0uｌ）或滴管、量筒
(六）注意事项
二、DEＡE－纤维素层析纯化蔗糖酶
(一）实验目的
学会离子交换柱层析法纯化蛋白的方法,掌握各步骤的实验原理,并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
(二）实验原理（略)
（三)实验仪器、材料及试剂
仪器
1.核酸蛋白检测仪、自动部分收集器、蠕动泵、层析柱、梯度混合器
2.滴管、真空泵或抽滤瓶、烧杯等。
材料及试剂