不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
泳动度
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQ
➢ 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状 • 电场强度：电压 • 缓冲液：成分， pH ，离子强度 • 支持介质：电渗作用，吸附作用 • 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势
梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。 ➢ (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 ➢ (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
电泳技术概述
▪ 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
NH3+
NH2
P
P
COOH
COO-
COO-
pH＜pI
pH＝pI
pH>pI 分子带负电荷，在电场中向正极移动; pH<pI分子带正电荷，在电场中向负极移动;
分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻 力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。
㈠、凝胶电泳
凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高 聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半 乳糖结合的链状多糖。
琼脂糖
琼脂
脱去SO42-丙酮酸酯基
影响泳动度的因素
2．溶液pH
➢ 溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定 其所带电荷的多少。
➢ 对蛋白质而言，溶液pH值离等电点(pI)越远，则 颗粒所带的净电荷越多，泳动速度也越快；反之， 则越慢。
影响泳动度的因素
3．溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高，则颗粒的电
动电势越小，泳动度也越小。一般最适合的离子强度在 O.02～O.2之间。
第十四章 电泳分离技术
一、电泳技术概述
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电 泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。
20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的 电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及 琼脂作为支持物。
60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支 持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具 有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
琼脂胶
应用
➢由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用 微不足道。
➢因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广 （200bp-50kb的DNA）.
▪ 琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度 0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液； 浓度常用1%-1.5%。
▪ 琼脂凝胶电泳的优点： ➢ 近似自由界面; ➢ 液固相间无明显界面，电泳速度快; ➢ 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定; ➢ 容易染色易洗脱.
• 区带电泳(zone EP)
• 只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一
个个台阶状的图形;
• 等速电泳(isotachophoresis)
• 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速 移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电
泳，它的区带没有重叠，而是分别保持; • 等电聚焦 (isoelectricfocusing)
6．支持物 要求是均匀，吸附力和电渗小，机械 性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明， 无紫外吸收。
三、电泳的分类
按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、平 板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙 烯酰胺电泳、自由电泳；
按分离原理分类
• 移界电泳（moving boundary EP）
➢ 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带， 可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出— 个个互相分离的峰;
相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：
缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连 续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子 筛效应。
电泳作用效应
分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的 蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不 同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。
• 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成 pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带， 分辨率很高。
混合 移界
分立 区带
稳态 时毗邻
等速
稳态
时分立静
止
pH
等电聚焦
9 876
ABC CBA
ABC BA AB BA B A AB
+
根据操作方式分类
1.连续系统： 缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。 ▪ 如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的
缓冲液带正电荷向负极移动。
影响泳动度的因素
5．温度 电泳时会产生焦耳热，使介质黏度下降， 分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使 样品中的生物大分子变性失活。
▪ 因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却 散热装置。
pH＞ pI
(一)、泳动度u (迁移率):
带电质点在单位强度电场下的泳动速度
u:泳动度or泳动率(cm/ d:泳动距离:cm
伏·秒or分)
t:电泳时间:秒/分
V:泳动速度:cm/秒or分 E:电场强度:伏特/cm
U:电压:常压(100—500v)
高压(500—10000v)仅需几分钟
l:支持场的长度 (有效长度)