用 1.5 ml Microtube 收集（分为 2 管，每管 1 ml）。最后用空气将 Cellulose Cartrige Colum 内 的溶液全部吹出。 c） 洗脱液用真空离心等方法干燥后，用 100 μl 左右的灭菌蒸馏水溶解，经适当稀释后进行 HPLC 分析。
注：Cellulose Cartridge Column 不能重复使用。
TaKaRa Code：D4480
Pyridylamination Manual Kit （20 次量）
说明书
宝生物工程(大连)有限公司
目录
内容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●PA 化反应的操作方法 ●PA 化糖链的纯化方法 ●对照实验例 ●参考文献
页码
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●制品说明
本试剂盒是利用 2-Aminopyridine（2-氨基吡啶， 2-AP）对糖链进行荧光标记（PA 化）的试剂盒。使用 本试剂盒不需要特殊的 PA 化设备，操作简单，回收率 高。 对糖链进行 PA 化标记反应时，首先是糖链的还原末端 与 2-氨基吡啶反应形成西夫碱（Schiff Base），西夫碱 在还原剂的作用下生成稳定的糖链氨基吡啶衍生物 （PA-糖链），PA-糖链是一种稳定的荧光诱导体，检测 灵敏度高。（原理见图 1）。 对糖链进行 PA 化标记后，使用试剂盒中的 Cellulose Cartridge Column 进行层析，能够高效除去反应后的 残存试剂，回收 PA-糖链。使用这种方法要比使用糖质 PA 化标记专用设备（如 PALSTATION 或 GlycoTAG 等通过蒸发除去反应后的残存试剂）的回收效果好。 本试剂盒标记的 PA-糖链具有荧光性，可以通过 HPLC 对糖链进行高灵敏度的分析。
④ Cellulose Cartrige Column 的洗净。 注射器中吸入 10 ml*1 的试剂 1，安装到 Adaptor 上，以 1 滴/秒左右的速度推出液体，清洗 Cellulose Cartrige Column*2。整个操作过程要始终保持柱子中有液体。最后注射器内吸入 2 ml 左右的空气， 把 Cellulose Cartrige Column 内的液体吹出。
注 2：配制均一的偶联试剂，在常温以下时有时能发生凝固，此时需要加热融化。由于粘度较大，适 当搅拌有助于融解。
③ 还原试剂的配制。 称量 Borane-dimethylamine Complex 20 mg 装入 1.5 ml 的 Microtube 中，加入 100 μl 的 Acetic Acid，充分振荡溶解。
向标记反应后的 PA 化糖链样品 40 μl 中，加入 1 ml 的试剂 1，充分振荡混匀。此样品要进行离心操作，保持悬浊液的状态直接上样。 注 2：充分振荡后，样品溶液仍然明显分为两层时，可用试剂 1 稀释，有可能均一化。如果试剂 1 的
照糖链差别较大时，建议首先进行预实验，以寻找最适合的反应条件。
* 本试剂盒中附带的对照糖链 Biantennary Sugar Chain 的结构
●制品内容（20 次量）
本试剂盒分为-20℃保存和常温保存两部分。 【-20℃保存部分】
2-Aminopyridine Borane-dimethylamine Complex Biantennary Sugar Chain（500 pmol/50 μl） PA-Biantennary Sugar Chain（100 pmol/100 μl）
注 2：本还原试剂应现用现配，配制后请于当天使用。
2． PA 化操作方法。 ① 将糖链样品（50 pmol～50 nmol）装入带有螺旋盖的 1.5 ml Microtube 中，用真空离心或冻结干
燥等方法将样品充分干燥。
注：糖链样品应尽量除去盐类、蛋白质、脂质等杂质，在 PA 化标记反应前可以使用 Cellulose Cartridge Glycan Preparation Kit（TaKaRa Code：D4403）或者凝胶过滤柱层析等方法纯 化。
Cellulose Cartridge Column。 c） 重复上述 b）操作 2 次。 d） 注射器内吸入空气，将 Cellulose Cartridge Column 中的水完全吹尽。 e） 注射器内吸入 10 ml 的试剂 2，安装到 Adaptor 上，以 2～5 滴/秒的速度推出液体，清洗 Cellulose
*1 上样的样品量过多时，可按样品量+洗净液（试剂 1）量 = 12 ml 的比例调整洗净液量。 *2 洗出液先收集保留，待分析结果出来后再废弃。
⑤ 糖链的洗脱。 a） 取 2 ml 的试剂 2 加入至上述④的未安装有 Adaptor 的 Cellulose Cartrige Column 内。 b） 按顺序安装上 Adaptor、吸入空气的注射器，慢慢推进注射器（以出液速度 1 滴/秒为宜），洗脱液
加量达到 5 ml 仍分为两层时，通常是样品中的杂质原因，特别是盐类含量太高等，有可能导 致样品得不到充分 PA 化标记。此时，我们建议再次干燥，进行凝胶过滤柱层析除盐后，重新 进行 PA 化反应。
③ 上样操作。 a） 样品溶液振荡混匀后，加入至上述①处理的未安装有 Adaptor 的 Cellulose Cartrige Column 内。 b） 按顺序安装上 Adaptor、吸入空气的注射器，慢慢推进注射器（以出液速度 1 滴/秒为宜），最后注
【说 明】
图 1. 糖链的 PA 化反应过程
PA 化的反应效率和利用 Cellulose Cartridge Column 回收标记的 PA-糖链的回收率，受糖链样品本身结
构的影响。本试剂盒最适于对具有两个分支的复合型糖链 N-Glycan（试剂盒中附带的对照糖链 Biantennary
Sugar Chain*）进行标记。用于标记的糖链的结构，特别是糖链还原末端残基的种类和糖链的分子量与对
300 mg×2 瓶 100 mg×2 瓶
50 μl 100 μl
【常温保存部分】
Cellulose Cartridge Column（0.5 ml） Adaptor Syringe（10 ml）
20 个 1个 3个
-1-
【本试剂盒以外需要自备试剂】 ① n-Butanol ② Ethanol ③ Acetic Acid ④ Ammonium Bicarbonate ⑤ 灭菌蒸馏水
（分析纯以上） （分析纯以上） （分析纯以上） 75 mM 水溶液
约 500 ml 约 500 ml 约 5 ml 约 500 ml
●保 存
-20℃保存部分： -20℃保存。 常温保存部分： 常温保存。
●PA 化反应的操作方法
1． 仪器的准备和反应试剂的配制。 ① 将恒温箱或水浴设定至 80℃（也可以使用加热块，但其控温稳定性不太好，往往得不到良好的实验
●对照实验例
将试剂盒中的试剂 Biantennary Sugar Chain 10 μl（100 pmol），按照上述操作步骤，进行 PA 化标 记反应及纯化。将得到的 PA 化糖链，与试剂 PA-Biantennary Sugar Chain 同时进行 HPLC 分析比较， 确认 PA 化收率。简单方法如下：
意不要让 Cellulose Cartrige Column 干燥，让微量溶液保留于充填剂的上端。 注：溶出液先收集保留，待分析结果出来后再废弃。
c） 用 1 ml 的试剂 1 清洗样品管，将清洗液同样加入 Cellulose Cartrige Column 内，然后按照 b）的 方法进行操作。
-3-
50000 40000 30000
A B
Fliorescence
20000
10000
0
0
20
40
60
Time (min)
A：PA 化后的 Biantennary Sugar Chain（本实验样品）。 B：内部标准品 PA-Sugar Chain 003（TaKaRa Code: D4103）*。
* 本试剂盒中不备有，需要另行购买。
注 1：由于 Borane-dimethylamine Complex 极易吸潮，称量时应首先将制品瓶于室温下复温，然后 在湿度较低的地方称量。称量操作要迅速，可按实际使用量称量，再按比例加入 Acetic Acid。 称量后的 Borane-dimethylamine Complex 瓶要盖严，然后用封口膜等封严。
-4-
HPLC 条件： Column：TSKgel Amide-80（4.6×250） （TOSOH Code：01371） Solvent A：500 mM Acetic Acid-Triethylamine（pH7.3）/CH3CN/H2O（10/75/15） Solvent B：500 mM Acetic Acid-Triethylamine（pH7.3）/CH3CN/H2O（10/50/40） Gradient：0～0%B/0～15 min，0～100%B/15～65 min，100～100%B/65～75 min, 0～0%B/75～90 min Flow Rate：1 ml/min Fluorescence Detection：Ex：310 nm，Em：380 nm Column Temperature：40℃
结果）。 ② 偶联试剂的配制。
向装有 300 mg 偶联试剂（2-Aminopyridine）的制品瓶中加入 100 μl 的 Acetic Acid，可在 80℃ 左右加热，并用振荡器充分振荡溶解，配制后的试剂量约为 250 μl。
注 1：用 300 mg 的 2-Aminopyridine 配制的偶联试剂可以做 10 次反应。使用后的剩余试剂请转移至 1.5 ml 的 Microtube 中，于-20℃密封冻结保存，此偶联试剂请于 3 个月内使用。
Cartridge Column。最后注射器内吸入空气，将试剂 2 完全吹出。 f） 注射器内吸入 10 ml 的试剂 1，安装到 Adaptor 上，以 2～5 滴/秒的速度推出液体，清洗 Cellulose