➢ 基因表达谱数据
基因表达谱可以用一个矩阵来表示，每一行代表一个基因，每一列代表一个样本（如图1）。
所有基因的表达谱数据在“gene_exp.txt ”文件中存储，第一列为基因的entrez geneid ，第2~61列是疾病样本的表达，第62~76列是正常样本的表达。
图1 基因表达谱的矩阵表示
➢ 寻找差异表达的基因：
原理介绍：
差异表达分析是目前比较常用的识别疾病相关miRNA 以及基因的方法，目前也有很多差异表达分析的方法，但比较简单也比较常用的是Fold change 方法。
它的优点是计算简单直观，缺点是没有考虑到差异表达的统计显著性；通常以2倍差异为阈值，判断基因是否差异表达。
Fold change 的计算公式如下：
normal
Disease
x x c Fold =
_
即用疾病样本的表达均值除以正常样本的表达均值。
差异表达分析的目的：识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义。
我们利用一种比较常见的T 检验（T-test ）方法来寻找差异表达的miRNA 。
T 检验的主要原理为：对每一个miRNA 计算一个T 统计量来衡量疾病与正常情况下miRNA 表达的差异，然后根据t 分布计算显著性p 值来衡量这种差异的显著性，T 统计量计算公式如下：
n
s n s x x t normal Disease normal
Disease miRNA //22+-=
对于得到的显著性p 值，我们需要进行多重检验校正（FDR ），比较常用的是BH 方法（Benjamini and Hochberg, 1995）。
1+
=N
v
t分布
程序实现：
●基因表达谱数据--- gene_exp.txt
●Matlab软件实现mRNA差异表达分析：
MATLAB软件安装好之后，双击系统桌面的MATLAB图标，或在开始菜单的程序选项中选择MATLAB快捷方式，即开始启动MATLAB。
初次启动MATLAB后，将进入MATLAB默认设置的桌面平台。
桌面平台包括命令窗口、历史窗口、当前目录窗口和工作间管理窗口等窗口（如图2）。
图2 matlab窗口简介
工作空间主要包含了目前用户定义的一些变量，用户可以在命令窗口执行一些特定的命令操作来完成特定的功能。
我们首先将工作目录选择到我们数据存放的硬盘目录下，然后导入要分析的基因表达谱数据，进行差异表达分析。
在命令窗口输入main_MTDN_end.m程序中的1-21行命令（注意要将程序中的目录改变到自己数据的存储目录下），即可得到差异表达的基因。
这段程序主要包含两个函数：mattest和mafdr。
mattest函数是进行t检验的，输入的数据为疾病和正常的表达谱数据，返回每个miRNA的T统计量和对应的p值。
这个参数还可以利用‘Permute’参数进行随机扰动，'Showhist'参数用来显示T统计量和p值的分布。
mafdr函数是用来计算FDR的函数，可以利用参数来选择计算FDR的方法，这里我们利用“BHFDR”参数来选择BH方法对p值进行校正，利用'showplot'参数来显示FDR的图示结果。
结果可以在工作空间窗口中通过双击变量进行查看。
结果展示：
T-统计量和p值的分布图以及FDR：
图3 T-score，P-values以及FDR的分布
●差异表达mRNA：我们卡的阈值为FDR<0.1；2倍fold change
（Fold_c>2 or <1/2 ），我们识别了11个下调的mRNA和6个上调的mRNA。
差异表达基因的层次聚类分析
➢mRNA表达谱数据：差异表达17个mRNA的表达数据
➢程序实现：
我们接下来利用差异表达mRNA的表达谱进行聚类分析，在命令窗口输入main_MTDN_end.m程序中的23-30行命令，结果会输出利用差异表达mRNA聚类分析的结果。
这部分主要是利用一个现有的函数clustergram进行聚类分析，函数的输入数据是差异表达mRNA的表达谱。
之后可以利用set 函数对行的符号和列的符号进行设定。
➢聚类分析结果展示：
➢
➢聚类做heatmap，我比较喜欢用pheamap，简单又好看，但是很多做heatmap
的函数都不带输出聚类后基因名字的功能。
heatmap旁标注基因是很有用的信息，
论文中经常会用到，所以我们可以更改pheatmap的源代码，让它输出基因列表，
其实如果能够给出基因list，在heatmap旁边标注出list中的基因就好了，但有了基因列表也可以做这个事情。
➢
➢从cran上下载pheatmap的源代码，打开pheatmap的R文件夹中pheatmap.R文件，在一大串#上面添加write_matrix = function( mat,
out_file ){
➢write.table(as.data.frame(mat),sep="\t",quote=FALSE, file=out_file)
➢}
➢
➢在一大串#下面的pheatmap中添加out_file = NA，此乃默认参数设定。
➢
➢在hclust之后，就是当cluster_mat函数处理了mat矩阵后，添加
➢if( !is.na(out_file) ){
➢write_matrix( mat, out_file )
➢}
➢
➢**************************************************昏割线
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➢
➢打开Rstudio，tools--install packages--选择那个压缩包ok啦
➢用法：
➢>setwd("F:/project/PTEN/01.RPKM/correlation")
➢>dataframe <- read.table("correlation.txt",header=TRUE)
➢>pheatmap(dataframe,color=colorRampPalette(c("steelblue1","black","yel low"))(50),out_file="F:/project/gene/new.txt")
➢基因名字输出到new.txt中了。