基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
然后将这些cDNA探针与过量的来自driver的mRNA（其poly-A尾已与生物素耦联）杂交，大部分单链cDNA探针和driver中的mRNA形成异源双链，并通过羟基磷灰石柱层除去cDNA×mRNA杂交体，以此富增tester中特异的cDNA。
消减杂交法的最大优点是它适用于未被克隆的基因组片段；其次它特别适于寻找那些由于缺失造成突变的基因。
但这一方法需要大量的driver mRNA才能使消减杂交充分进行，所回收的cDNA量也很低，而且操作步骤复杂、耗资费时、重复性差，目标序列的富集程度仅能达到100~1 000倍。
如果基因组过大，则会导致野生基因组和变异基因组间的杂交复杂化。
如果分离缺失突变的基因，则需要缺失的DNA片段有一定长度。
传统的消减杂交法对mRNA的质和量要求都很高，而且很难获得低丰度的差异基因（李文雍，陈清轩，2004）。
2mRNA差异显示（mRNA differential display，mRNA DD）mRNA DD是由Liang和Pardee（Liang P et al.，1992）于1992年最先建立的，这一方法的根据是，所有mRNA 3′端均有polyA结构，而且其3′末端与polyA 相邻的2个碱基只有12 种组合（即GG GC GT GA CC CG CA CT TT TG TC TA）。
因而设计寡聚dT与polyA配对，并外加2个针对相邻的12组碱基的配对碱基，后者被称作锚碱基（AA AG AT AC GG GC GT GA CC CA CT CG），这样共需12组引物，每组引物锚定总mRNA的1/12，故这种引物又称为锚引物。
锚引物与mR NA 3′端锚定后，在逆转录酶作用下，逆转录合成cDNA的第一链；而后加入任意引物，经变性后，以cDNA第一链为模板，经过低温复性，造成任意引物与cDNA第一链错配，而后在Tag 酶作用下，进行cDNA第二链的合成。
最后在上述2种引物的共同引导下，进行PCR扩增。
因不同mRNA扩增产物大小不同，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过自显影或荧光显色检测，可得到mRNA 的指纹图谱。
2种以上细胞的指纹图经比较即可得到差异表达的mRNA带，可进一步扩增、筛选、克隆和鉴定。
mRNA DD是一种极其有效的研究基因行为差异的方法，该方法简单、快速，具有重复性好、灵敏度高、多能等特点，在分离与分化、发育、细胞周期调节、癌变及疾病相关的基因方面得到了广泛应用。
3代表性差异分析（representationdifferenceanalysis，RDA）1993年Listsyn（Lisitsyn N et al.，1993）等在消减杂交的技术基础上发展的分析基因组DNA差异的方法，Hubank（Hubank M et al.，1994）等将其改进后用于cDNA分析。
将实验组的mRNA逆转录为cDNA，采用识别4或6个碱基的限制性酶酶切消化，在5′末端接上寡核苷酸接头进行PCR扩增，换接头后与过量对照组cDNA混合，经变性、复性去除两者的共同部分，将双链两端都含有的差异分子作指数放大，最后通过电泳分析将占优势的差异分子克隆到载体等方法获得新分子基因。
RDA与单纯消减杂交技术相比更具有代表性、富集效率更高，对起始材料要求低，适合小型实验室开展。
但是它步骤繁多，最后富集片段小于1kb，且对低丰度的mRNA检出水平有待进一步提高。
4基因表达的序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）SAGE是Velculescu等建立的一种基因分析方法，可以快速和详细地分析成千上万个基因（李文雍，陈清轩，2004）。
它的主要依据：一是来源于转录体特定位置的9~10个碱基的核苷酸序列包含足够的信息，能唯一确认一个转录体；二是对一个克隆中一系列标签的测序并将它们联系起来就可以对转录体进行分析。
基本过程：生物素化的引物将mRNA逆转录为cDNA，将双链cDNA用锚定酶消化，消化后的3′cDNA通过生物素蛋白结合而分离，用锚定酶消化除去接头后，将含粘性末端的序列标签依次连接到一个载体中测序。
SAGE主要用于比较不同发育阶段和疾病不同时期基因表达谱的变化（Velculescu VE et al.，1995），不足之处在于产生双标签时，接头分子会持续存在，这将很大程度上影响双标签的有效连接。
目前，SAGE主要应用于比较不同发育阶段和疾病时期基因表达谱的变化。
由NIH发起的肿瘤基因组解剖学计划（canser genome anatomy project，CGAP）和NCBI的UniGene已融入SAGE分析，它的应用还在不断的发展之中。
5抑制消减杂交（SuppressionSubtractiveHybridition，SSH）Diachenko（Diatchenko L et al.，1996）等在1996年建立抑制消减杂交法。
它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及功能（王涛，陆应麟，1998）。
随后，由于SSH具有假阳性率低、高敏感性、效率高及不需要昂贵的实验仪器等特点，被广泛应用于筛选差异表达的基因（顾克余，翟虎渠，1999；Zheng Y and Iames R C，2000；张强等，2000）。
SSH是抑制性PCR与消减杂交技术相结合的更简单、更快速地分离差异表达基因的方法。
消减杂交运用杂交二级动力学原理，即高丰度的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链DNA，使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。
抑制性PCR利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段的两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性抑制了非目的基因片段的扩增。
方法上先制备实验组、对照组cDNA，通过连接2个接头，进行消减杂交和巢式PCR，最后得到扩增的差异表达基因。
SSH的优点是：（1）SSH通过它的2次特异性杂交和2次PCR特异性扩增使假阳性率大大降低。
（2）具有高度灵敏性，通过均等化作用和对目标序列的富集，保证了低丰度的mRNA也有被检测到的可能。
一般说来，经过SSH，稀有丰度cDNA能富集1 000~5 000倍，这种富集作用使得低至每细胞1个拷贝的分子也可能被检出。
（3）提高了基因克隆效率，可同时分离上百个差异表达基因（von Stein OD et al.，1997），由于使用四碱基内切酶使基因组的复杂程度降低，大大提高了信息量。
（4）程序相对简单，操作简便易行，实验结果复杂程度低。
SSH的缺点是：对起始材料相对要求较多，不适于来源困难的样品，而且若为cDNA SSH则需来源样品保持新鲜，以防RNA降解造成信息的丢失，所需的mRNA在50~1 000ng，非酶切位点区域内的点突变、小缺失或插入均不能被有效的发现；得到的片段尚需扩增其全长（胡昌华，2004）；不能同时进行数个组织或细胞间不同处理的比较。
抑制消减杂交技术目前已得到了广泛的应用，已经渗透到了医学、病理学、发育生物学等各个领域。
6表达序列标签（expressed sequence tags，ESTs）ESTs是对一个cDNA克隆测序获得的部分片段，它为发现新基因，揭示基因表达以及调节信息提供了一种快速、有效的途径（Adams MD et al.，1991）。
一个全长基因转录本的cDNA序列可能包含多个重叠的EST，一般长300~500 bp，通常作为基因的标志。
由于没有认真校对，RPH 序列中有较多错误如碱基的插入或缺失等。
目前Genbank收集了几百万个EST序列，形成了庞大的EST 库，几乎代表了人类基因组中近10万个基因。
由于cDNA文库的复杂性和测序的随机性，有时多个EST代表同一基因或基因组，通过对所有EST分析，形成EST簇，每一个EST 簇独立代表特定的基因。
TIGR Gene Indices，UniGene，STACK是其中的几种EST 数据分析系统。
但是EST 缺少低表达基因的转录本，自动化测序中会出现一些错误，包括碱基的替代、插入和缺失。
随着大规模、高通量ESTs测序的进行，ESTs数据库正在迅速扩充，ESTs将发挥越来越重要的作用（宋宇轩，曹斌云，2004）。
7cDNA微阵列（cDNA microassay）cDNA微阵列又称基因芯片（gene chips）或DNA芯片，是将cDNA文库中已知和未知序列固定于固相支持物上，同时检测、比较生物样品中多个已知或未知序列的表达情况。
在固相支持物上印迹外源或原位合成寡核苷酸序列，同位素或荧光标记靶DNA，依不同目的选择杂交条件并杂交至芯片上，激光扫描、计算机分析即可得出相应基因的表达谱或测序结果、突变及多态性等信息（Hacia JG，1999；Pennist E，1999）。