1、取保存的DH5α大肠杆菌甘油菌株，在无抗性的LB平板上划线，过夜培养。

2、第二日下午，挑取单菌落接种在装有5ml LB培养液的15ml离心管中，在37℃恒温摇床200rpm震荡过夜。

同时准备1个锥形瓶以及100mM CaCl2、30％甘油溶液，高压灭菌后保存在4℃冰箱。

3、次日早上，取上一步骤得到的DH5α母液1ml加入到装有100ml LB培养液的锥形瓶中，37℃恒温摇床200rpm震荡2-3h。

4、在超净台上将100ml菌液分装在两个无菌的50ml离心管中，完全插入冰中，冰浴10min。

后于4℃离心机中4000rpm离心10min。

5、弃掉上清，倒置在滤纸上1min，加入10ml预冷的100mM CaCl2,轻轻震荡悬浮菌体，冰浴25min后离心收集菌体。

6、去除上清液后，再次加入1.5ml预冷的100mM CaCl2，小心悬浮菌液。

7、加入1.5ml30%甘油，轻轻混匀后，在冰上分装在1.5ml离心管中，每管100μl。

液氮速冻后保存于-80℃冰箱。