质粒提取实验回顾
三大步、七小步、四离心 三溶液及三合一 两注意
大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
2015.06.20
一、什么是感受态细胞（Competent cell）
细胞经过一些特殊方法的处理后, 细胞膜的通透性发生了暂时性改变, 成为能允许外源DNA分子进入的 状态，处于这种状态的细胞称为 Nature state 感受态细胞 。
转化、转染及转导之间的相同及不同 载体（vector) 病毒 质粒 噬菌体
转导 （Transduction)

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三、如何筛选转化成功的细胞 （发扬个性）
抗性筛选
总结
菌液 CaCl2
含有质粒 的细菌
“四步冷、一步热” （1）在制备感受态细胞时一定要在低温进行（温度的要求） （2）在热休克质粒转化的过程中一定要注意快速 （时间的要求）
重点及思考题 重点：
(1)CaCl2方法制备大肠感受态细胞的原理； (2)质粒转化过程的步骤及关键环节； (3)质粒转化后进行筛选的依据；
CaCl2方法的历史
斯坦利· 柯恩 Stanley Cohen
赫伯特· 波伊尔 Herbert Boyer
1973年实现了质粒DNA转化大 肠杆菌的感受态细胞 。
CaCl2 + 热击法 细菌+质粒 细菌含质粒
感受态制备及质粒转化
E.Coli DH5а （无质粒） p32质粒 （实验五提取得到的质粒）
Competent state
二、什么是转化及与其相似的概念 载体（vector) 病毒 噬菌体
转化 （Transformation)
转染 （Transfection)
质粒
转导 （Transduction)
PEI,脂质体， 磷酸钙等
/users/chagedor/biol_4684/Methods/genes.html
蓝白斑筛选
四、制备感受态细胞的方法
通常制备感受态细胞的方法有两种：电击法和化学法
两种方法比较 电击法（土豪法） 化学法（屌丝法） 转化效率高，但需要昂贵的设备 操作简单无需特殊设备，转化率较高
2
电击法制备感受态及转化的原理
+
-
CaCl2方法的历史
1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理 的生长期大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。
思考题：
（1）感受态细胞在生理上与普通细胞有何差异？这种差异 对于转经外源DNA有什么特别作用？
（2）影响转化率的因素有哪些？
（1）实验材料
（2）实验试剂
液体培养基 低渗MgCl2和CaCl2溶液
（1）CaCl2法制备大肠杆菌感受态过程
0.5
(小冷)
(大冷)
（2）质粒转化（Heat shock)
100ul
(0.5ul) 10分钟
100 5
加入200微升含有氨苄青霉素的液体培养基中， 37摄氏度，复苏30min.
（共冷）
（2）低温使得细胞膜的膦脂双分子层的流动性变慢
2、在“大冷”条件下发生了什么改变？
（1）低渗的CaCl2和MgCl2溶液使得细胞发生膨 胀
（2）Ca+2离子与细胞膜上的磷酸根离子结合
（3）低温条件下Ca+2会使细胞膜膦脂双分子层形成液晶结构， 促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域。
（4）Mg+2对于Ca+2具有协同作用
质粒转化的原理
3、感受态细胞和质粒共同冰浴时发生什么改变？
（1）质粒DNA可以围绕在感受态细胞周围 （2）Ca +2 又与质粒DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase） 的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在感受态细胞膜的外表面上
4、在热休克时发生什么改变？
短暂的42℃热脉冲处理，感受态细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，致使 细胞膜的通透性增加，质粒DNA分子便进入细胞内，完成转化。
冰上放置10分钟
100
5
（热激+复苏）
（3）质粒转化后的培养及筛选
氨卞霉素
液培中，将上述液体加到含有氨苄青霉素的固体培养 皿中，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，放置30分钟。
（个/ug）
(ug/ml)
CaCl2方法制备感受态的原理
1、在“小冷”条件下发生了什么改变？
（1）处于生长对数期的大肠杆菌细胞膜上存在大量的 Adhension zones