高脂饮食脂肪肝胰岛素抵抗大鼠中PPARα的表达对肝组织的影响王素格;李德征;蒋树林;秦明月【摘要】Objective To investigate the role of PPARa in NASH and IR of SD rats and the mechanisms in insulin resistance way. Methods 60 male SD rats were randomly divided into four groups: normal chow-fed control group ( re =20 );high fat-fed group ( re =20 );experimental group ( re = 10 );experimental control group ( re = 10 ). At the end of 12th week,each 10 rats which randomly selected form normal control group and the high fat-fed group were put into glucose clamp test and liver tissue HE staining to ensure the model succeeded. Then they were given normal chow-fed,fenofibrate and continue high-fat diet intervention, which took four weeks in all. Aminotransferase, triglyceride were measured by biochemical methods, and the mRNA expression level of PPARa genes were detected by the reverse transcriptase-polymerase chain reaction ( RT-PCR ) technique. Results Hyperlipidemia was observed in high fat-fed groups rats. Compared with normal chow-fed controls groups, PPARa mRNA expression was down-regulation( P < 0. 05 ), the steatosis and inflammatory activity in the livers and the insulin resistance were significantly increased( P <0. 05 );Compared with the high fat-fed group,PPARa mRNA expression in experimental group and experimental control group was up-regulation( P <0. 05 ),and the insulin resistance were significantly decreased. Conclusion PPARa' s mRNA is positively correlatedwith the IR. It is effective in cure of the rat' s NASH and IR after using the PPARa agonists.%目的研究PPARα在SD大鼠NASH、IR的形成中的作用,并初步从胰岛素抵抗方面探讨其机制.方法将SD大鼠60只随机分为正常组20只、高脂组20只、实验组10只(高脂加非诺贝特)、实验对照组10只(造模成功后改正常饮食).饲养12周末时随机取正常对照组与高脂组各10只一并做高胰岛素正葡萄糖钳夹实验及肝组织的HE染色,确定造模成功.然后给予非诺贝特、继续高脂饮食及改正常饮食干预,共4周.氨基转移酶、三酰甘油等以生物化学方法测定,并以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析PPARα基因的mRNA表达水平.结果高脂组大鼠呈高脂血症,与正常组相比PPARα的mRNA表达下调(P<0.05),胰岛素抵抗(IR)和肝细胞脂肪变及炎症程度加重(P<0.05);与高脂组比较,实验组及实验对照组的PPARα的mRNA表达上调(P<0.05),IR明显改善.结论在高脂饮食诱导的NASH、IR模型中,PPARα的mRNA表达水平与IR密切相关,它们可以共同促进NASH的进展,而使用PPARα激动剂后对大鼠NASH及IR起到了有效的治疗作用.【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2013(035)006【总页数】3页(P810-812)【关键词】非酒精性脂肪性肝炎;胰岛素抵抗;PPARα;非诺贝特【作者】王素格;李德征;蒋树林;秦明月【作者单位】邢台矿业集团总医院;邢台矿业集团总医院消化内科;050000,石家庄市,河北医科大学第二医院消化内科;河北大学医学部2010级临床本科一班【正文语种】中文【中图分类】R575.5近年来人们生活水平日益提高，而日常膳食中以脂肪为代表的高热量食物成分所占比例明显增加，使非酒精性脂肪肝炎(non alcoholic steatohepatitis，NASH)的发病率日益增长［1］，从而成为人们普遍关注的问题。
有大量研究发现，胰岛素抵抗(IR)是NASH发病的首要环节［2－4］，而过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisomeproliferator-activated receptoralpha，PPARα)是调节胰岛素敏感性的一个重要因子，并且它的激动剂可能减少肝脏的脂质沉积，从而使脂肪性肝炎得到改善，因此我们通过高脂饮食诱导脂肪肝胰岛素抵抗模型的成立，然后观察IR及PPARα的mRNA在NASH中的表达情况，为NASH的治疗提供新的药物作用靶点。
1 材料与方法1.1 建立动物模型雄性SD大鼠60只，体重120～160 g，鼠龄4～6周，分笼饲养在温度22～28℃动物室中，明暗各12 h，自由进食及饮水，适应性饲养1周后，随机分为4组，正常组20只、高脂组20只，实验组10只、实验对照组10只。
正常组喂饲普通饲料;高脂组、实验组、实验对照组喂饲高脂饲料［5，6］，其配方:普通饲料加1%胆固醇和10%蛋黄粉、10%猪油，－20℃冰箱保存，喂前平衡室温。
12周末时正常组与高脂组各取10只一并进行钳夹及肝组织石蜡切片HE染色，确定胰岛素抵抗脂肪肝动物模型造模成功;实验组在高脂饮食同时给予非诺贝特80 mg·kg－1·d－1灌胃;实验对照组将高脂饮食改为正常饮食;实验组每天定时给药，其余各组均给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，持续4周后所有大鼠分别测定胰岛素敏感性，然后处死大鼠留取所需标本。
1.2 主要试剂胆固醇购自南京新百药业有限公司，猪油由河北医科大学实验动物中心提供，非诺贝特(力平之)200 mg为法国利博福尼公司产品，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)采用德国Bbyer 公司的全自动血清生化分析仪检测，由河北医科大学第二医院生化室协助。
RNA提取试剂盒及GAPDH均为北京赛百盛基因技术有限公司产品。
1.3 观察指标及测定方法1.3.1 一般情况:每天观察动物的毛色、活动及粪便与进食水情况，每周测定大鼠体重。
1.3.2 空腹血清TC、TG、ALT、AST及血糖测定:用全自动生物化学分析仪测定，全部应用酶法完成。
1.3.3 病理学检查:中性甲醛固定肝标本，石蜡包埋，常规切片行HE染色，光镜下观察肝脏脂肪变性及炎症的程度。
由富有经验的病理医生在不知分组情况下作出诊断。
对肝脂肪变性和炎性细胞浸润程度分级、评分判断标准参照文献［7－9］。
1.3.4 IR的测定:用正常血糖高胰岛素钳夹技术［10］，求取60～120 min的13个GIR的平均值，该指标反应大鼠的胰岛素敏感性，GIR越小，机体的IR越严重。
1.3.5 PPARα的mRNA表达水平的测定:钳夹结束后迅速取出肝脏组织，冰上取肝脏同一部位切取1块肝组织约100～150 mg，将组织放入高压处理的EP管中，编号记录后迅速液氮冷冻保存，采用RT－PCR法检测PPARαmRNA的表达。
根据参考文献选取引物并合成，PPARα(Gen Bank网站)上游引物:5′－CCTGGAAAGTCCCTTATCT－3′，下游引物:5′－GCCCTTGCAGCCTTCACAT－3′，319 bp，GAPDH 上游引物:5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′，下游引物:5′－AGATCCACAACGGATACATT－3′，308 bp。
①RNA提取:用Trizol一步法提取总RNA，按说明书进行。
②逆转录:用20 μl体系逆转录RNA ，取总RNA 2 μl，随机引物(dN)9 1 μl，DEPC 处理水7 μl，5 × MMLV buffer 4 μl，dNTP 2 μl Rnasin 10 U/μl，MMLV RTase 1 μl，100 m MDTT 2 μl，70℃5 min，37℃ 1 h 94℃ 5 min。
③PCR 反应体系20 μl:取2 μl逆转录产物进行 PCR，10 × Taq 缓冲液2 μl，PCR 染料2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，0.1 mmol/L，dNTP，上下游引物各20 pmol。
PCR扩增反应条件为:预变性94℃、5 min、1 min;变性 94、30 s，退火(PPARα 56℃;GAPDH 56℃)40 s，延伸72℃、45 s，循环数(PPARα 35次;GAPDH 30次)，终末延伸72℃、10 min。
模板量及循环次数经检测均在线性范围内。
PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，以UVP计算机图像扫描分析系统Robocycler 4.0测定电泳条带密度值，以GAPDH为内参照，Excel计算PPARα基因mRNA的相对含量，结果以PPARα条带占GAPDH条带密度的百分率表示。
1.4统计学分析应用SPSS 14.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验、秩和检验、方差分析和直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 一般情况 4组大鼠均生长良好，至实验结束时无1例死亡。