大肠杆菌中质粒的小量提取及核酸电泳摘要：采用碱裂解法将大肠杆菌中的质粒DNA分子进行分离和纯化，将分离纯化后的质粒DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外成像仪中观察DNA条带，以测定所得到的质粒DNA片段的分子量大小。
结果表明，成功从大肠杆菌中提取出质粒DNA分子，其分子量大小约为2000bp。
关键词：质粒DNA分子；碱裂解法；分子量；电泳引言质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在碱性电泳缓冲液中带负电荷，所以在外加电场作用下会向正极迁移。
将提取到的DNA 分子提取液中加入核酸染色剂，经过琼脂糖凝胶电泳后，利用紫外灯照射即可观察到所提取的DNA条带，第一泳道加入合适的Marker 与之进行比对，即可较为准确地估测出所提取出的质粒DNA分子量。
1 材料与方法1.1 实验材料(1) 含质粒Psd-T19的大肠杆菌(2) 试剂：细菌质粒小量提取试剂盒、琼脂糖，电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。
1.2 实验仪器微量移液器、试管、微波炉、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、天平。
1.3 质粒的提取（小量试剂盒提取）(1) 首先取1.5ml混匀的菌液于1.5ml离心管中，台式离心机中12000r/m离心1min，弃上清液得到大肠杆菌菌体；(2) 按照试剂盒提取的步骤提取出大肠杆菌质粒DNA。
1.4 核酸电泳(1) 制备1%琼脂糖凝胶，并添加GoldVied I核酸染料；(2) 加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。
采用梯度上样，上样量分别为2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量标记；(3) 电泳：120V，40min；(4) 观察：将电泳后的凝胶放置于透射紫外光下进行观察，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小。
2 实验结果与分析大肠杆菌在37℃恒温摇床中220r/min培养24h，离心收集菌液收集菌液，之后按照试剂盒的操作步骤进行质粒提取纯化，最后进行核酸电泳，电泳图如图1-1所示。
其中1,2,3,4分别代表质粒的上样量分别为2µL，4µL，6µL，,8µL，M代表5µL标准品。
DNA分子的分子量、分子构型的差异和所带电荷多少，都会影响电场中其迁移速率，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH 和电泳时的温度等也影响迁移率，从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。
如图1-1所示，从大肠杆菌中提取的质粒DNA分子的分子量大小为2000bp，梯度上样的对比结果表明最适上样量为6ul。
图1-1 1％核酸电泳图3结论所提取的质粒DNA分子量为2000kb，琼脂糖凝胶电泳最适上样量为6ul。
参考文献[1] 叶枫,董兴齐,彭何碧.四种提取细菌质粒DNA方法的比较[J].地方病通报,1994,9(4):66.[2] 黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J].湛江师范学院学报，2009，30(6):83-85.鸡肝中过氧化氢酶的提取、分离及检测摘要：为得到鸡肝中的过氧化氢酶，首先从肝中提取可溶性的蛋白质，并测定其蛋白质的含量和过氧化氢酶的活力；然后采用硫酸铵分级盐析及透析，并测定过氧化氢酶活力；最后采用SDS-凝胶电泳鉴定过氧化氢酶的纯度和测定其分子量。
选用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，利用分光光度计测定过氧化氢酶活力。
结果表明，纯化后过氧化氢酶的总活性是4774U，比活性是155.43 U/(mg.N)，回收率是34%，纯化倍数是4.88，考马斯亮蓝G-250染色法测定的蛋白质含量是15.41mg/ml，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示蛋白质的相对分子质量是。
关键词：蛋白质含量；酶活力；盐析及透析引言过氧化氢酶（Catalase，CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶[1]。
其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理[2]，其次过氧化氢酶的应用也十分广泛[3]。
CAT在不同的组织中其活性水平高低不同。
过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高[4]。
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
以牛血清白蛋白(BSA)为标准品配制浓度梯度标准液，用考马斯亮蓝G-250法进行吸光值的测定，作标准曲线，依据标准曲线推算样品中蛋白质含量[5]。
酶活力单位指每毫升样品在反应体系中每分钟催化1nmolH2O2 降解定义为一个酶活力单位。
过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶(Catalase)活性的试剂盒。
过氧化氢酶的活性可以用紫外分光光度计测定A240，H2O2在240nm有特征吸收峰，CA T能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小[6]。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
1材料与方法1.1 实验材料(1) 新鲜鸡肝、低分子量标准蛋白、透析袋。
(2) 试剂：硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白标准液、过氧化氢酶检测试剂盒、聚丙烯酰胺、SDS、TEMED、4%浓缩胶、12%分离胶、样品缓冲液、染色液、脱色液、电泳缓冲液。
1.2 实验仪器可见分光光度计、研钵、冷冻离心机、电泳仪、垂直板电泳装置。
1.3水浸提法提取过氧化氢酶(1) 肝脏研磨液的制取；(2) 水浸提法提取过氧化氢酶按研磨液与水的体积比为1:5计算，加入相应体积的样品提取缓冲液浸提，浸提温度为25℃，浸提时间为5 h左右。
4℃10000r/min离心20 min，得上清液备用；(3) 将上清液分为3份：一份用于测总蛋白含量及过氧化氢酶活性；一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE电泳；另取一份用于盐析、透析等。
1.4 过氧化氢酶粗酶液的分级盐析及透析(1) 将硫酸铵研磨成粉末加入粗酶液中，使达40%饱和度（使大部分杂蛋白沉淀），在电磁搅拌器上边搅拌边加入，然后置冰箱放置1～2h。
(2) 12000 r/min冷冻离心20min。
收集上清液S1（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。
上清液中再加入硫酸铵使达80%饱和度，放置1h左右，12000r/min冷冻离心20min，收集上清液S2（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。
(3) 将第二次离心的沉淀复溶于1/20原始体积的缓冲液中，装入透析袋中，用大量的此缓冲液在冰箱中进行透析过夜（4℃），其间更换缓冲溶液约3-4次，直至无白色沉淀析出为止（用BaCl2溶液检查）。
透析完毕后，将提取液保存于冰箱中备用，取部分提取液测总蛋白及酶活力，也留部分进行SDS电泳。
1.5 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量1.5.1蛋白标准曲线的制作以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制牛血清蛋白含量标准曲线。
1.5.2样品测定取一支试管，加入末知浓度稀释20倍的蛋白质溶液1ml，考马斯亮蓝G250试剂5ml，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595nm。
对照标准曲线求得末知蛋白浓度。
1.6 过氧化氢酶活力的测定(1) 分光光度计预热30min，调节波长到240nm，蒸馏水调零。
(2) 测定前将CAT检测工作液25℃水浴10min。
(3) 加入10ul样本和190ul工作液，混匀5s并立即计时，记录240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。
CAT（U/ml）=反应液总体积÷样本体积÷反应时间÷H2O2消光系数（43.6×10-3）×△A=459×△A1.7 SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量(1) 配胶：4%浓缩胶、12%分离胶。
(2) 制备凝胶板：混合分离胶各组分，用移液管快速加入分离胶，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置至溶液聚合。
(3)加样样品在沸水中加热5min，去掉亚稳态聚合，上样量10ul。
(4) 电泳：开始电压恒定在70V，当进入分离胶后改为150V，溴酚蓝距凝胶边缘约1cm时，停止电泳。
(5) 凝胶板剥离与染色：取出凝胶板，加入染色液，染色30min 左右。
(6) 脱色：蒸馏水漂洗，脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
2实验结果与分析考马斯亮蓝G-250染色法测定的牛血清蛋白含量标准曲线方程为y=0.0062x+0.0072(R2=0.9985)，标准曲线图如图1所示。
图1牛血清蛋白含量测定标准曲线图表1酶液酶液总体积（ml）蛋白质（mg/ml）酶活性（U/ml）总活性（U）比活性[U/(mg.N)]回收率（%）纯化倍数粗酶液57 7.66 244 13912 31.85 100 1 上清S1 59 5.37 190 11210 35.38 81 1.11 上清S2 55 0.95 / / / / / 透析后11 15.41 2395 4774 155.43 34 4.883结论参考文献[1]刘昌玲,王国庆.细菌过氧化氢酶的分离结晶及性质[J].生物化学与生物物理进展,1900,17(5):380-383.[2]黄永洪,花慧,等.猪肝过氧化氢酶提取条件的研究[J].生物技术通讯,2005,16(1):40-42.[3]张坤生,田荟琳.过氧化氢酶的功能及研究[M].食品科技,2007,1:8-11.[4]刘冰,梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展[J].中国农学通报,2005,21(5):223-232.[5]王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[M].天津化工,2009,23(3):13-14.[6] 朱广廉,杨中汉. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量[M].植物生理学通讯,1982(2)：43-47.。