人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义郭 荣,邹 萍,邹典斌1(华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,武汉430022;1郑州大学医学院第一附属医院血液科,郑州450052)摘要 为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原,通过流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。
研究发现:①脐血及骨髓淋巴细胞中均测到幼稚淋巴细胞(CD3-CD4+),且前者中含量较多,但脐血细胞毒T细胞含量(CTL,CD3+CD16+56+)低于骨髓;②脐血中N K细胞(CD3-CD16+56+)比例高于骨髓;③脐血有核细胞中CD34+细胞的比值接近于骨髓,但脐血CD34+细胞中髓系祖细胞(CD34+ CD13+,CD34+HLA2DR+)及淋巴系祖细胞(CD34+CD19+)含量均低于骨髓。
结论:①脐血免疫细胞具有不成熟性,这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因;②脐血淋巴细胞中N K细胞含量较高,推测脐血移植后移植物抗白血病效应(GVL)并不会降低;③脐血CD34+细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。
关键词 脐血;骨髓;淋巴细胞;免疫表型中图分类号 R33111;R331.2A Comparison bet w een Immunophenotypes of Lymphoid Cells from H uman Umbilical Cord Blood and Bone Marrow and Its Signif icanceGUO Rong,ZOU Ping,ZOU Dian2Bin1(Instit ute of Hematology,The A f f iliated U nion Hospital,Tongji Medical College,Huaz hong Science and Technology U niversity, W uhan430022,Chi na;1Depart ment of Hematology,The Fi rst A f f iliated Hospital of Medical College of Zhenz hou U niversity, Zhenz hou450052,Chi na)Abstract To compare the expression of CD antigens on immune cells from umbilical cord blood(UCB)and bone marrow(BM)and analyze its clinical significance,the phenotypes of lymphoid cells and nucleated cells from38UCB and 10BM samples were investigated by flow cytometry with double labeling monoclonal antibodies.The results showed that the immature lymphocytes(CD3-CD4+)were detedcted in UCB and higher than those in BM;cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD16+CD56+)in UCB were significantly lower than those in BM.N K cells(CD3-CD16+CD56+)in UCB were higher than those in BM.The ratio of CD34+cells in nucleated cells of UCB was similar to that of BM,however,both the contents of myeloid(CD34+CD13+and CD34+HLA2DR+)and lymphoid(CD34+CD19+)progenitor cells in UCB were lower than those in BM.It is concluded that the immune cells in UCBpossess immaturity,which might lead to mild GVHD after UCB trans plantation.It is infered from the higher ratio of N K cells in UCB,GVL will not decrease after UCB transplantation.The lower contents of myeloid and lymphoid progenitor cells in UCB probably accounted for the slow hematopoiesis and immune reconstitution following UCB transplantation.K ey w ords umbilical cord blood;bone marrow;lymphoid cell;immunophenotype 脐血具有经济、来源广、采集方便、无采集并发症,移植后移植物抗宿主病(graft versus host dis2 ease,GV HD)程度轻,移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应不降低等优点。
但是脐血也存在造血重建速度慢,易合并感染的问题。
本研究应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对脐血和骨髓免疫细胞分化抗原进行检测,比较二者在淋系祖细胞、髓系祖细胞、幼稚淋巴细胞及N K细胞含量方面有无差别,旨在分析二者免疫表型差异,探讨其在扩大脐血应用范围中的作用和意义。
材料与方法标本采集无菌条件下采集正常足月分娩新生儿脐血38份。
母亲年龄24-35岁,平均(29.3±3.3)岁。
新生儿娩出后,立即(不超过30秒)用止血钳在距脐轮2-3cm处夹住脐带,在两钳间剪断脐带,用含少许肝素的注射器抽取脐血,加入离心管中混匀。
骨髓 通讯作者:郭荣 电话:(027)85730575.E2mail:gh7311@yahoo. ・915・中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(6):519-522取自10名健康志愿献髓者(男6例,女4例),年龄20-45岁,平均(32.7±9.1)岁。
采集用肝素抗凝的髂骨骨髓2-3ml,注入试管中混匀。
脐血有核细胞计数常规计数2次,取其平均值。
脐血及骨髓细胞单克隆抗体标记取新鲜抗凝的脐血及骨髓50μl。
在4只离心管均先加入CD342FITC单抗,再分别加入CD382 PE,HLA2DR2PE,CD192PE或CD132PE鼠抗人单抗各20μl;另取2只离心管先加入CD32PE,再分别加入CD42CY或CD16+562CY鼠抗人单抗各20μl。
室温避光孵育30分钟后加入1ml红细胞裂解液(01155mol/L N H4Cl,0101mol/L KHCO3,0101 mmol/L ED TA,Becton Dickinson,USA),混匀后孵育9分钟,PBS21%BSA洗2次,最后加入0.5ml 0.1%多聚甲醛固定液混匀。
阴性对照管加入20μl PBS,同型对照管加入鼠抗Ig G12FITC/Ig G22PE各20μl,操作同上。
所用荧光标记单抗均由美国PharMingen公司提供。
FACScan Cell Q uest测定及Stas数据分析以FCM测定CD34+细胞及其亚群中各表面抗原表达率。
流式细胞仪为FACScan型(Becton Dickinson,USA)。
具体操作参照文献[1]。
采用对数获取,每个样品测定200000个细胞。
第1荧光探测器(FL1),第2荧光探测器(FL2)及第3荧光探测器(FL3),分别反映FITC,PE及CY的荧光强度。
测前以Autocomp软件结合Calibrite Beads调正校对器,计算其变异系数(CV),使其稳定在2%以内,再以过滤的无颗粒PBS高速运行2分钟,以去除Flow中可能存在的气泡。
统计学处理采用t检验,应用SPSS8.0数据统计软件分析实验结果。
结 果脐血及骨髓有核细胞中CD34+细胞及其各亚群的含量38份脐血平均容积为(115.7±22.4)ml。
有核细胞计数为(10.4±2.9)×109/L,平均每份脐血有核细胞含量为1.2×109,CD34+细胞含量为4.7×106。
脐血有核细胞中CD34+细胞的比值接近于骨髓,但脐血CD34+细胞中髓系祖细胞(CD34+ CD13+和CD34+HLA2DR+)含量及淋巴系祖细胞(CD34+CD19+)含量均低于骨髓(见附表及附图)。
脐血及骨髓淋巴细胞中各亚群含量脐血中细胞毒T细胞含量(CTL,CD3+CD16+ 56+)低于骨髓,但其中N K细胞(CD3-CD16+56+)比例高于骨髓,P值均小于0.01(附表及附图)。
T able Comparison of subsets of CD34+cells and lymphocytes in cord blood and bone marrow( x±s)Subset of CD34+celland lymphoid cellCord blood(%)(n=38)Bone marrow(%)(n=10)CD34+ 0.39±0.173 0.35±0.19CD34+CD38+82.76±9.51388.54±5.79CD34+CD13+58.66±4.823373.98±5.92CD34+CD19+ 1.49±0.503319.89±3.65CD34+HLA2DR+66.27±9.563382.41±8.47CD3-CD16+CD56+18.10±4.163310.44±3.14CD3+CD16+CD56+0.83±0.4533 2.09±0.46CD3+CD4+11.05±3.45311.45±1.69CD3-CD4+9.18±3.0733 2.98±2.61 3P>0.05and33P<0.01,compared with that of bone marrow讨 论本研究检测了脐血免疫细胞表面标志的表达情况,并将其与骨髓中细胞的相应标志进行比较,以探讨脐血与骨髓移植相比有那些优势及不足之处,为脐血移植的临床应用提供理论依据。