分光光度法测量溶液中色素含量一、引言（实验背景）在物质检测分析领域，对样品测试时往往直接采用化学方法，或先采用化学方法预处理后再采用物理方法进行测试分析，这样都要采用化学试剂，对环境造成二次污染。

而纯物理方法在整个测量过程没有化学反应，更多依赖于物理手段和数学处理来解决问题，符合环境友好型社会的发展需求，受到国家的重视和社会各界的欢迎。

随着测试方法的转变，人才需求也随之发生转变。

以往利用化学分析方法进行物质检测分析，需要大批量化学、生物相关专业人才。

而随着物理测试方法的广泛采用，光学、光电专业人才需求越来越大。

为了顺应社会需求，适应形势变化，光学、光电专业学生不仅要掌握制造分光光度计的技术，还要创新使用方法，通过实验训练积累知识和经验，以便达到社会人才需求标准，为推动社会的技术进步和发展作贡献。

二、实验目的与内容食品中常添加色素使外观好看而吸引消费者，特别是食品饮料中常常使用人工色素配制成各种颜色。

而毒理学证明化学合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。

各国相继制订了法规，对食品中合成色素的使用做了限量规定。

本实验目的就是要采用光学方法测出溶液中常用的色素含量。

溶液中常使用三种色素显示黄色、橙色或红色：柠檬黄、日落黄和胭脂红，本实验要求：(1)实验前一周进行预习查资料，设计出使用分光光度计同时测出溶液中柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的实验方案，实验方案包括：1）实验所需条件，包括仪器设备、材料试剂、工具器材等；2）配制哪些溶液？测量哪些数据？并设计好记录数据的表格以及主要实验步骤（注：分光光度计输出的数据量较大，每个样品的测量结果以文件形式保存，请先拟好文件名，填入表格，以免搞错）；3）由实验数据计算柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的方法，并说明所需使用的软件或拟编写的程序。

实验设计方案至少提前一天（需要特殊材料的方案须提前一周）交给任课老师审阅，通过审阅后方可进行实验。

(2) 实验时，按照所设计实验方案，配制所需溶液，并使用分光光度计测出相应的光谱数据；数据记录单须交老师审查签字。

(3) 实验结束后按数据处理要求进行数据处理，一周内上交实验报告，实验报告包括实验方案、实验原始数据、数据处理结论及误差分析、思考题。

三、 实验原理分光光度法是根据物质对不同波长的单色光的吸收程度不同而对物质进行定性和定量分析的方法，常采用吸收光谱曲线来进行分析。

所谓吸收光谱曲线，即将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A 表示），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图所画出曲线。

由于溶液对不同波长的光的吸收程度是不同，不同溶液的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同，如图1所示，可以作为定性分析的基础。

20025030035040045050055060065070075080050100150200λ1Maxλ3Maxλ2MaxAλ/nm图1不同溶液的光谱吸收曲线1760年，朗伯通过研究后指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比b K II A 00lg== (1) A 为吸光度；I 0为入射光强度；I 为透射光强度；b 为液层厚度；K 0为比例常数。

1852年，比耳(Beer)提出光的吸收和光所遇到的吸收物质数量有关；即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度成正比。

C K II A 10lg== (2) A 为吸光度；I 0为入射光强度；I 为透射光强度；C 为溶液的浓度；K 1为比例常数。

将朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，则为朗伯-比耳(Lambert- Beer)定律bC TI I A ε===1lg lg0 (3) 式中：A 为吸光度；T 为透射率；b 为液层厚度(光程长度)，通常以cm 为单位；C 为溶液的浓度，一般为物质的摩尔浓度，单位为mol ·L -1；ε为摩尔吸光系数，单位L ·mol -1·cm -1；（注意：吸光系数有三种表示方式：摩尔吸光系数，单位L·mol -1·cm -1，对应浓度单位为mol/L ；吸光系数，单位L · g –1 · cm -1，对应浓度单位为g/L ；比吸光系数，单位100mL · g –1 · cm -1，对应浓度单位为g/100mL 。

）需要说明的是，（3）式中的比例系数ε对不同波长的光，其值是不同的，所以吸光度A 随波长呈变化的曲线。

同一溶液，不同浓度，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，根据朗伯-比耳定律，其吸光度与溶液浓度成正比，如图2所示，可利用吸收曲线结合吸光度对溶液物质含量进行定量分析。

3004005006007008000.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.80Aλ/nm0.01mol/L0.08mol/L0.16mol/L图2 同溶液不同浓度光谱吸收曲线所以，对于单组分溶液，根据最大吸收峰处的吸光度，即可算出溶液中该物质的浓度。

具体方法是：先配制已知浓度的溶液，测出吸光度，根据（3）式计算出吸光系数；而后再测待测样品的吸光度，由（3）式计算样品的浓度。

对于多组分溶液，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加和性，根据朗伯-比耳定律有：∑=ni i i bC A ε (4)如各组分光谱有叠加，则通过解联立方程组可以确定各组分的浓度。

以三组分混合液为例，先用混合液绘制出吸收光谱，再分别用其中的每单一组分绘制出各自的吸收光谱，而后根据所测三条吸收谱线选择三个合适的波长，在这三个波长处对混合物样品进行测定，其方程式如下：3132121111bC bC bC A εεε++= (5) 3232221212bC bC bC A εεε++= (6) 3332321313bC bC bC A εεε++= (7)应用行列式克莱姆法则，则可计算获得C 1、C 2、C 3。

同一物质，不同的测试波长有不同的摩尔吸收系数，即有不同的灵敏度，由于实际实验有误差，吸光度较小处相对误差较大，而最大吸收波长处的摩尔吸光系数最大，分析测试的灵敏度最高，且最大吸收波长处吸光度绝对误差A ∆变化最小，所以三个波长分别选在三种物质的吸收峰处较合适。

当用分光光度计进行测量时，一般会对波长进行扫描，即同时给出许多波长下的测量值，这时为了充分利用现有数据减小误差，可采用最小二乘法对数据进行处理（参考附录3）。

一般情况下，采用分光光度法对某种物质进行测量时，物质的吸光系数是未知的，为了获取物质的吸光系数，常用下列方法：绝对法：选择待测物质的吸收峰波长，通过书刊、手册查阅待测物质在吸收峰波长处吸光系数，利用实验所得的吸光度或透射率或反射率计算获得待测物质浓度。

标准对照法：在同样的条件下配制标准溶液及试样溶液，在所选波长处分别测量吸光度，获得标准溶液及试样溶液的A 标及A 样，通过样标样标C C A =A 获得样品浓度。

标准曲线法：配制一系列已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测其吸光度A，然后以标准溶液的浓度C为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制A-C关系图，获得标准曲线和标准关系方程。

在相同条件下测量样品溶液的吸光度，根据标准曲线和标准关系方程即可获得样品溶液浓度。

标准加入法：在样品溶液中加入已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测量其吸光度，根据吸光度变化量和所加已知具有不同浓度的标准溶液浓度变化量的关系，进而获得样品待测物含量。

分光光度计是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，它主要由光源、单色器、吸收池、检测器、信息显示系统组成。

分光光度计结构组成框图如图3所示。

图3 分光光度计结构框图光源主要提供符合要求的入射光，较常用氘灯(165-375 nm)和钨灯(320-2500nm)。

单色器是将光源发射的复合光分解成连续光谱并可从中选出任一波长单色光的光学系统，主要由狭缝、色散元件（棱镜、光栅）和透镜系统组成。

吸收池又叫比色皿，是用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件，主要有石英吸收池和玻璃吸收池两种。

检测器是利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号的器件，常用的有硒光电池、光电管、光电倍增管等。

四、实验仪器和试剂仪器：UV-4501S紫外可见分光光度计，TU1901紫外可见分光光度计（带两个1cm 石英比色皿）；基本操作步骤见附录1。

电子天平；容量瓶、移液管、烧杯等玻璃仪器。

试剂：柠檬黄、日落黄、胭脂红（试剂说明见附录2）；乙酸铵；光学纯水；五、思考题(1)分光光度计有哪些类型？分别有什么特点？(2)测定过程中产生误差的原因有哪些，并简要进行分析？注意事项：(1)在配制所需浓度溶液过程中，天平读数要精确；玻璃仪器要轻拿轻放，配制完后，清洗干净放回原处。

(2)所配制溶液浓度在最大吸收波长处吸光度最佳范围为0.2~0.8，相当于本实验所用溶液浓度范围为20~200μg/mL。

浓度高低也可以用一定体积（与使用的容量瓶有关，如100mL）中含储备液多少来表示（如1mL，3mL等），可称“体积浓度”。

等数据处理完成后，再将它转换成标准浓度单位。

(3)在一次测量完成后，比色皿须经光学纯水清洗，待测浓度溶液清洗后，再加入待测溶液进行测试。

(4)分光光度计测量常常涉及数十个甚至上千个波长数据，要想利用好这些数据，就可能要解数目巨大的方程组，所以仅靠手工计算是不可能的，需要编程计算或利用软件计算。

本实验提供VB编写的计算软件程序或自行采用MATLAB软件或其他软件进行计算。

附录1：光谱仪基本操作步骤(1)开机，仪器参数设置：1)打开分光光度计电源开关，预热约20min；2)在Windows操作系统下启动光谱仪程序，待计算机与光谱仪通讯成功，可进入主工作程序；3)选择附属功能-狭缝设置设定狭缝宽度。

狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，仪器的增益提高，仪器噪声增大，于测量不利。

4)选择附属功能-波长设置设定波长范围，波长范围太大，测试时间太长，并增加数据处理量，增加误差；波长范围太小，不能完全覆盖物质的吸收光谱宽度，测试数据不全，增加测量误差；因而选择合适的波长范围，可以有效减少误差。

5)选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-模式选择吸光度或透射率；6)选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-参数设置对扫描次数、扫描速度、起止波长、坐标上下限进行设定；7)在参考通道与物光通道分别插入装有蒸馏水的石英比色皿，盖好防尘盖，选择附属功能-建立基线进行基线扫描。