1.2 同源查询途径
通过已存入数据库中的基因顺序与 待查的基因组序列进行比较，从中查找 可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于 界定基因的方法称为同源查询。
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同源有如下几种情况：
A DNA序列某些片段完全相同； B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； D 模拟多肽高级结构相似
编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密 码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。
不同种属间使用同义密码的频率有很大差 异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多 为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。
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G 外显子－内含子边界
外显子和内含子的边界有一些明显的特征， 如:内含子的5’端或称供体位（donor site） 常见的顺序为 5’－AG↓GTTAAGT-3’； 3’端又称受体位（acceptor site), 多为 5’PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸， T或C)；
(CLONTECH)
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3’RACE
(CLONTECH)
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3.确定DNA序列中基因的位置
A 通过对全长cDNA序列的测序、对比， 以及与基因组DNA的比较，确定基因所 在的区域；
B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定 基因的位置；
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4.实验确认基因功能
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B 信号肽分析
信号肽分析软件(SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP )
把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序列翻译 为蛋白序列;
然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个 ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果 SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信 号肽;
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c 基因表达产物丰度的问题
如果风度较低，用拟Northern 杂交和动 物杂交（Zoo-blotting）分析。
拟Northern 杂交—— 根据已知的DNA顺序 设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物， 再以DNA为探针与之杂交。
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动物园杂交—— 根据亲缘关系相似的 物种，其基因的编码区相似性较高，而 非编码区的同源性很低的原理。如果某 一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物 种的DNA片段杂交产生阳性信号，该 区段可能含有1个或多个基因，这种方 法又称为动物园杂交。
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2 获取基因全长cDNA序列A 构建cDNA，用目的基因DNA片段 筛选。
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22整理课件cDNA构建(CLONTECH)cDNA
文 库 构 建
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B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得 到基因的全长cDNA序列。
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5’RACE
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C 终止密码子
终止密码子: TAA, TAG,TGA
GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次；
GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出 现一次；
由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最 可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。
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D 3’端的确认
第三讲 基因组序列诠释
问题
基因组序列所包含的全部遗传信息是什 么？
基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因、研究基因的功能
呢？
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1. 寻找基因
1.1 根据开放读码框预测基因
A 起始密码子 ATG
第一个ATG的确定(依据Kozak规则);
Kozak规则是基于已知数据的统计结果. 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列 的碱基分布所满足的统计规律.
另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依 据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。
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I 软件预测
采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi ) 判断ORF的可能范围。
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H 上游控制序列
几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它 们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。
通过同源性比较来预测mRNA的5’端，最常用的 与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库
(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )。
3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列, 若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则 根据加尾信号序列“AATAAA”和 BLAST同源性比较结果共同判断。
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E 非编码序列、内含子
高等真核生物多数外显子长度少于 100 个密码子，有的不到50个密码子 甚至更少；
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F 密码子偏爱性
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1.3 试验分析
Northern 杂交确定DNA片段是表达序列.
注意事项：
a 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由 于连接的外显子不同，会产生好几条长度不 一的杂交带;
如果该基因是某一基因家族的成员也会出现 多个信息；
b 考虑组织专一性和发育阶段的问题；
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Kozak规则:
若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别 标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
(1) 第4位的偏好碱基为G；
(2) ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱 基T；
(3) 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；
(4) 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏 好碱基。
通过增加基因的 拷贝数和采用强启 动子促使基因超表 达,致使受体表现出 生长与发育的异常, 来研究基因的功能.
4.1 基因剔除(knock-out)
最简便的基因失活的方法.
主要原理:
在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换
基因两侧相同的序列,将这一构建导入目的细
胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取
代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用
于取代的外源DNA中含有报告基因.
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4.2 基因超表达