F 密码子偏爱性

同义密码：编码同一氨基酸的不同密码子， 差别在于密码子的第3位碱基 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异， 如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为 GCA、GCC、GCT, GCG很少使用 种属特征性密码子序列在编码区出现，非编 码区只保持平均的碱基分布水平
中英联合实验室
13
根据序列分析搜寻基因
A B C D E F G H I 起始密码子 ATG 信号肽分析 终止密码子 3’端的确认 非编码序列、内含子 密码子偏爱性 外显子－内含子边界 上游调控序列 软件预测
中英联合实验室
6
根据开放读码框(ORF)预测基因
A 起始密码子 ATG
第一个ATG的确定(依据Kozak规则) Kozak规则--基于已知数据的统计结果 第一个ATG侧翼序列的碱基分布所的亚群进一步筛选 cDNA均一化：抑制高拷贝cDNA，增加低拷贝

cDNA数量。DNA复性动力学

合适条件下，多数高拷贝cDNA呈双链，中低拷 贝cDNA呈单链 羟基磷灰石柱吸附双链cDNA 收集单链cDNA
中英联合实验室
23

5’RACE (CLONTECH) 中英联合实验室


G 外显子－内含子边界

外显子和内含子的边界有明显的特征 内含子的5‘端或称供体位（donor site）常 见的顺序为 5’ -AG↓GTTAAGT-3’ 3’端又称受体位（acceptor site)，多为 5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’ (Py：嘧啶核苷 酸，T或C)
中英联合实验室
中英联合实验室
32
1.基因失活
基因的功能实现--一个过程，从基因到表型的一 系列生理生化反应过程 正向遗传学：传统的遗传分析，从表型出发最 终到达基因 反向遗传学：现代基因功能研究方法，与传统 遗传分析相反，从基因出发，最终到达表型 基因组计划中基因功能研究：基因到表型。通 过系列实验方法鉴别与目标基因相关的表型 基因失活是基因功能分析的主要手段
5 基因组序列的诠释
中英联合实验室
1
问 题
基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因、研究基因的功能？
中英联合实验室
2
基因组序列的诠释

研究基因组的最终目的--诠释基因组所包含的 信息和基因组功能。

1. 在基因组中搜寻基因 根据序列分析搜寻基因 实验分析确认基因
①建立生物模型。 基因功能、代谢途径等研究中模型生物的建立非常 重要。基因敲除技术建立某种特定基因缺失的生物 模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞 ，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的 是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因 敲除模型也常见于报道。 ②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研 究它对机体的影响。对于了解疾病的根源、寻找基 因治疗的靶目标都有重大意义。


10
D 3’端的确认
Poly(A)尾序列 若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根 据加尾信号序列“AATAAA”，与 BLAST同源性比较结果共同判断
中英联合实验室
11
E 非编码序列、内含子
高等真核生物多数外显子长度 少于100 个密码子，有的不到50个 密码子甚至更少
中英联合实验室
12


特定生物基因组的特有组成-- CpG岛，脊椎动物基因组 许多基因的上游promotor都有，长度1kb，GC比例高
中英联合实验室
15
I 软件预测
采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.c
gi )判断ORF的可能范围
21
5.1 在基因组中搜寻基因

如何获取基因全长cDNA序列？确定其在cDNA序列的测序、对比，以及与基 因组DNA的比较，确定基因所在的区域；通过物 种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；

中验室
9


C 终止密码子

终止密码子: TAA, TAG,TGA

GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次
GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出现一次 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可 能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子
中英联合实验室
24
3’RACE (CLONTECH) 中英联合实验室
25
5.2 基因功能的测定
一. 利用计算机分析基因功能 二. 实验分析确定基因功能
中英联合实验室
26
一.利用计算机分析基因功能
同源性确定基因功能

同源基因都拥有一个共同的祖先基因，有许 多相似序列。同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因（orthologous gene）： 不同物种之间的同源基因，来自物种分化以前的 共同祖先 种内同源基因或平行基因（paralogous gene） 同一物种内的同源基因，常常是多基因家族的不 同成员。其共同祖先可能存在于物种形成以后， 也可能存在于物种形成之前
中英联合实验室
36
基因敲除基本步骤

ES细胞的获得 基因载体的构建
目的基因导入筛选靶细胞Biblioteka 观察生物学性状的改变
中英联合实验室
tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir neor 新霉素抗性基因→G418
中英联合实验室
38
中英联合实验室
39


基因敲除技术的应用及前景：
中英联合实验室
4
5.1 在基因组中搜寻基因
高等真核生物DNA的ORF的阅读障碍： 基因间存在大量非编码序列（人类基 因组占70%） 很多基因含有内含子 由于多数外显子长度<100个密码子， 当读码进入到内含子时很快就遇到终 止密码，从而难以判断读码的准确性
中英联合实验室
5
5.1 在基因组中搜寻基因
2. 基因功能测定
中英联合实验室
3

5.1 在基因组中搜寻基因

ORF（opening reading frames）扫描：人工或计算机 序列筛选

ORF：每个编码蛋白的基因都含有ORF，由一系列密 码子组成，通常以ATG开始，TAA、TGA、TAG结束。 通过寻找起始密码子和终止密码子确定ORF序列，是 寻找基因的一种重要的方法 成功关键：终止子在DNA序列中出现的频率。
14


H 上游调控序列


几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，与 DNA结合蛋白作用，控制基因表达 原核生物调控序列有明显特点，参考 真核生物
基因上游控制序列差异较大 通过同源性比较来预测mRNA的5’端 真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )
中英联合实验室
35
基因剔除(knock-out)
基因敲除
最简便的基因失活的方法. 1987年建立， 2007年获诺贝尔生理医学奖 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基 因两侧相同的序列, 导入目的细胞,由于同源片段 之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色 体中. 为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报 告基因
中英联合实验室
7
Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1, 2 , 3位， 侧翼碱基序列具有以下特征：

第4位的偏好碱基为G
ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基
中英联合实验室
中英联合实验室
29
中英联合实验室
30
同源性分析在酵母基因组计划中的应用

酵母基因组大约含有6000个基因， 30％--通过传统遗传学分析得到
70％--通过同源性分析获得
中英联合实验室
31
5.2 基因功能的测定
二. 实验分析确定基因功能



基因失活 基因超表达 噬菌体展示 （phage display） 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
中英联合实验室
33

基因失活
基因剔除（knock-out） 反义RNA技术 RNAi技术
转座子插入突变
中英联合实验室
34
5.2 基因功能的测定

基因剔除（knock-out） 最简单的基因失活方法，用一段无关的 DNA片段取代目标基因。
主要原理：用一段无关的核苷酸序列取代目
标基因的中间序列，导入生物体内或目的细 胞内，如果该基因所控制的表型发生变化， 即从反面验证了目标基因的功能。
中英联合实验室
20
5.1 在基因组中搜寻基因

DNA序列中基因位置的确定

分子杂交可以判断DNA片段中是否含有基因，但 不能给出基因定位信息 cDNA测序：获得基因定位信英联合实验室


cDNA测序受两个方面的影响：

8



B 信号肽分析

信号肽分析软件(SignalP) http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP 把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序 列翻译为蛋白序列 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列 (从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始) 进行评估，如果SignalP分析给出正面结果， 则测试序列有可能为信号肽