第17卷 第4期 医学研究生学报 Vol.17 No.4 2004年4月 Journal of Medical Postgraduates Apr.2004・论 著・铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究黄建军, 胡晓梅, 朱军民, 申晓冬, 李 明, 饶贤才, 胡福泉(第三军医大学基础部微生物学教研室,重庆市微生物工程重点实验室,重庆400038)摘要: 目的:确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2结构蛋白的构成及其编码基因。
方法:CsCl 梯度离心纯化噬菌体PaP2颗粒,SDS 2PAGE 电泳,确定结构蛋白条带及其相对分子质量;然后电转印于PVDF 膜上,用Edman 降解法进行N 端测序。
根据所测的N 端氨基酸残基序列在PaP2预测基因编码的蛋白质中检索,从而逆推其编码基因。
结果:SDS 2PA GE 显示PaP2含有10条带,其中1、3、4、5、8、9等6条带的含量足以回收进行N 端测序,测得N 端氨基酸残基分别依次为:Met 2Ile 2G lu 2Leu 2G ly 、Ala 2Ile 2Ser 2Pro 、Ala 2Arg 2Phe 2Ile 2Asp 、Ser 2Val 2Tyr 2Ala 2G ly 、Ala 2Ile 2Ser 2Arg 2Asn 2和Ser 2Phe 2Ser 2Leu 2G ly 。
据此推论出它们的编码基因分别是ORF183********、ORF441926419、ORF16589218322、ORF827429530、OrF157********、ORF756328309。
结论:噬菌体PaP2含有10个结构蛋白,其中6个主要结构蛋白的编码基因分别是orf 24、orf 8、orf 23、orf 12、orf 22、orf 11。
关键词: 铜绿假单胞菌; 噬菌体; 蛋白质N 端测序; 编码基因中图分类号: Q939.48 文献标识码: A 文章编号: 100828199(2004)0420292204ΞThe constituent proteins of Pseudomonas aeruginosa phagePaP 2and their responding coding genesHUAN G Jian 2jun ,HU Xiao 2mei ,ZHU J un 2min ,SHEN Xiao 2dong ,L I Ming ,HU Fu 2quan(Depart ment of M icrobiology ,the Thi rd M ilitary Medical U niversity ,M icrobiologic Core L ab of Chongqi ng ,Chongqi ng 400038,Chi na )Abstract : Objective :To identify the constituent proteins and their responding coding genes in Pseu 2domonas aerugi nosa phage PaP2. Met hods :Phage particles of PaP2were purified with the method of CsCl gradient centrifugation.The phage constituent proteins separated by SDS 2PA GE were trans 2ferred to a PVDF filter ,six major bands were excised from the membrane and were subjected to N 2ter 2minal sequence with Edman degradation method.The coding genes of the six proteins could be identified by comparing their N 2terminal sequences with amino acids sequence of the coding sequences of PaP2genome. Results :PaP2particles are separated to at least eight bands by SDS 2PA GE.The N 2terminal sequences of six proteins are in turn :Met 2Ile 2G lu 2Leu 2G ly ,Ala 2Ile 2Ser 2Pro ,Ala 2Arg 2Phe 2Ile 2Asp ,Ser 2Val 2Tyr 2Ala 2G ly ,Ala 2Ile 2Ser 2Arg 2Asn and Ser 2Phe 2Ser 2Leu 2G ly.Their concluded coding genes are ORF183********,ORF441926419,ORF16589218322,ORF827429530,ORF157********,ORF756328309. Conclusion :There are ten constituent proteins in PaP2particles.Six corresponding coding genes of them are orf 24,orf 8,orf 23,orf 12,orf 22,orf 11res pectively.Their physical and chemical properties are figured out in this study.K ey w ords : Pseudomonas aerugi nosa ; Phage ; N 2terminal sequencing ; Coding gene・292・Ξ收稿日期: 2003211227基金项目: 2000年度重庆市攻关项目(批准号:6458)作者简介: 黄建军(19692),男,四川岳池人,博士研究生,助理研究员,主要从事噬菌体基因组学研究。
通讯作者: 胡福泉(19532),男,四川珙县人,教授,医学博士,主要从事抗微生物感染及噬菌体基因组学研究。
0 引 言 铜绿假单胞菌噬菌体PaP2是我室自行分离的一株溶原性噬菌体,目前已完成其全基因组测序(基因组为43kb的dsDNA)。
经ORF finder搜索表明基因组中具有154个大于100bp的公开阅读框架(open reading frames,ORF),G eneMark分析提示有51个编码序列(coding sequences,CDS)。
这些预测是生物信息学分析软件的分析结果,需要实验证据来证实;反过来,这些预测结果可以为寻找结构蛋白的编码基因提供帮助。
研究表明,不同噬菌体基因组大小不同,其结构蛋白在数量上差别也较大,多者可达40个以上,少的仅有几个,而且结构蛋白的一级序列差别也非常大,甚至同一宿主菌的不同噬菌体也经常没有任何保守的结构蛋白质1～4。
应用BLAST软件(/)分析噬菌体PaP2,没有检索到与现有蛋白同源的结构蛋白质,故无法确定PaP2的结构蛋白及其编码基因。
本研究首先对纯化的噬菌体PaP2颗粒蛋白作N端测序,根据其在51个预测基因编码的蛋白质中检索结果,确定PaP2结构蛋白的编码基因并分析其特性,为深入研究PaP2打下基础。
1 材料和方法1.1 铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的纯化 PaP2为本室自行分离鉴定株5。
将PaP2和宿主菌混合液200ml经DNaseⅠ及RNase A消化,除去细菌残渣后,用PEG8000沉淀噬菌体颗粒,用4ml TM液溶解,加在密度分别为1.45g/ml、1.50g/ml、1.70 g/ml的三层CsCl梯度液上,22000r/min离心2h,收集二、三层之间的灰蓝色区带,透析后即得到纯化的PaP2颗粒。
1.2 噬菌体PaP2蛋白的SDS2PA GE 参照《分子克隆实验指南》第二版6,配备12%分离胶和5%积层胶,在PaP2纯化颗粒和中分子量蛋白质标准中分别加入等量2×加样缓冲液,煮沸5min后上样电泳。
30V约40min后换为90V,待溴酚蓝指示剂到达凝胶下缘时,停止电泳。
用考马斯亮蓝R2250染色观察。
1.3 PaP2蛋白转印PVDF膜 参照网站http:// www.expasy.ch/ch2d/protocols/protocols.fm8. html/提供方法。
将平衡好的PVDF膜、Whatman 滤纸和SDS2PA GE后切去积层胶的凝胶制备三明治夹层,由正极到负极依次为:三层Whatman滤纸、PVDF膜、稍小于PVDF膜的凝胶块、稍小于凝胶块的三层Whatman滤纸,4℃恒压30V电转印过夜。
取出PVDF膜染色、脱色。
1.4 蛋白质的N2端测序 剪下PVDF膜上各蛋白质条带送北京大学生命科学院进行N2端测序,使用Edman降解法,在ABM494A蛋白测序仪上完成。
1.5 主要结构蛋白编码框的确定 根据实验测得的N2端氨基酸残基序列,从G enemark所预测的51个基因表达的蛋白质中查询对应的编码框。
1.6 主要结构蛋白质的一般性质分析 通过DNASTAR和网站http://www.expasy.ch/可对这些结构蛋白的相对分子质量(MW)、等电点(p I)和氨基酸组成等进行分析。
2 结 果2.1 噬菌体结构蛋白的SDS2PA GE图谱 SDS2 PA GE结果见图1。
电泳后,在凝胶上可以清晰地看到10条带,按相对分子质量从大到小依次编为1～10号,其中第1、3、4等3条带的含量很大,是主要的结构蛋白。
图1 PaP2噬菌体蛋白SDS2PA GE电泳图谱Figure1 SDS2PA GE of Phage PaP2constituent Proteins(lane1、2)and molecular mass markers(lane M)2.2 噬菌体蛋白转印PVDF膜图谱 噬菌体蛋白先经SDS2PA GE分离,再转印到PVDF膜上,染色后如图2所示。
SDS2PA GE分离产生的蛋白条带,经转印后在PVDF膜上有9条清晰可见,只有凝胶上的第7条带为肉眼不可见。
2.3 主要结构蛋白N2端测序结果 切下转印后PVDF膜上各条蛋白带进行测序。
结果得知,凝胶上的第1、3、4、5、8、9带对应蛋白质N2端氨基酸残基序列分别依次是:Met2Ile2G lu2Leu2G ly(M IqL G)、Ala2Ile2Ser2Pro(A ISP)、Ala2Arg2Phe2Ile2Asp (ARFID)、Ser2Val2Tyr2Ala2G ly(SV YA G)、Ala2Ile2 Ser2Arg2Asn(A ISRN)和Ser2Phe2Ser2Leu2G ly(SF2 SL G)。