1、目的
采用邻苯三酚自氧化法测定大蒜不同部位的SOD酶活性
2、原理
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（m g∕mL）;每ml 样品中的酶活性单位数（U∕mL）。

酶的纯度越高酶的活性也就越高。

SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。

在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。

利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。

加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm[1]处测定溶液的吸光度。

酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。

邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加[1,2]。

3、仪器、试剂和材料
1)仪器
UV-260紫外分光光度计（或其他型号），比色杯，样品管，自氧化管
2)试剂和材料
a)取培育的大蒜等量的须根，茎，叶；
b)所用试剂邻苯三酚、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP)、
EDTA-2Na、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、
30%H2O2、三(羟甲基)氨基甲烷、浓HCl,均为分析提纯。

c)Tris-HCl 缓冲液
4、操作步骤
4.1SOD粗酶液的提取
称取鲜重3.00 g的样品,加入少量预冷的pH=7.8的磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L的EDTA、质量浓度为4 %的聚乙烯吡咯酮烷),冰浴研磨.将匀浆液于4 000 r/min下离心20 min.取其上清液,于60℃水浴15 min,待其冷却后,于4 000 r/min离心20 min,弃去沉淀,将上清液定容到10 mL容量瓶,4℃冰箱中保存备用[3,4]。

4.2SOD酶活性测定
采用邻苯三酚自氧化法测定[5,6].取两支试管按表1的试剂用量,将缓冲液加入试管并在25℃保温25 min,加入定量预热的邻苯三酚,倾入1 cm比色杯中,迅速摇匀,在波长325 nm处每隔30 s测定吸光度一次,测定3 min内每分钟光吸收值的变化,要求自养化速率控制在每分钟吸光度的变化速率在0.070(±0.002)左右(可增减邻苯三酚的加入量,以控制吸收值)。

SOD酶活测定方法与邻苯三酚自氧化测定相同.样品管取代自氧化管,样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚.其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定,控制加酶后每分钟吸光度的变化速率在0.035(±0.001)左右.然后计算SOD酶活。

表1 大蒜SOD酶活性测定反应体系[6]
酶活性计算公式：
U／mg=(0.070－△A325)×100%×V总/[0.070×50%·V。

·V S] 其中：
△A325：反应吸光值变化值；
V总：反应总体积(mL)；
V S：加入样品液的体积；
V。

：活力单位定义体积（1mL）。

表2 大蒜不同位置的SOD酶活
【参考文献】
[1] 许雅娟,赵艳景,胡虹. 邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化
酶活性的研究[ J ]. 西南民族大学学报: 自然科学版, 2006, 32 ( 6 ) :1208212121
[2] 许申鸿,杭瑚,李运平. 超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法的研
究及改[ J ]. 化学通报, 2001 (8) : 51625191
[3] 覃鹏,刘飞虎,梁雪妮.超氧化物歧化酶与植物抗逆性[J].黑龙江
农业科学,2002(1):31-34
[4] 孙永君.大蒜中SOD的提取研究[J].化学与生物工程，2005
（10）:23-25
[5] 吉宏武.湛江海域14种主要海藻SOD含量与活力测定[J].食品研
究与开发,2006,27:102-106
[6] 张宏,谭竹钧.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
方法的比较[J].内蒙古大学学报(自然科学版)，2002，
（6）:33677-681。