包涵体纯化方案
缓冲液配方：
1. 变性复性缓冲液
①②
缓冲液 A： 50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA , 100mM NaCl ,1%Triton
③
X-100
缓冲液 B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100 ，④
2M 脲素
缓冲液 C： 50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100 缓冲液 D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100 ，
④
2M 盐酸胍
溶解缓冲液 E: 50mM Tris-HCI (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCI , 1OmM B -巯基
⑤⑥
乙醇 /DTT ， 2mM 脱氧胆酸钠， 8M 脲素
复性缓冲液： 50mM Tris-HCI (pH8.5)， 100mM NaCI ， 6M/4M/2M 脲素, 1 %甘氨⑦ ⑧ ⑨
酸,5%甘油,0.2%PEG , 1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷
⑩ 胱甘肽
2. 纯化缓冲液
Binding buffer ： 50mM Tris-HCI, 100mM NaCI, 10mM 咪唑， pH8.5
EIution buffer ： 50mM Tris-HCI, 100mM NaCI, 不同浓度梯度咪唑 , pH8.5
具体实施步骤：
1. 大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。

弃上清，用1 >PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm,离心10min。

再用PBS重复洗一遍。

离心后留菌体沉淀。

2. 将菌体细胞用缓冲液 A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。

13000rpm离心 10min，弃上清，收集包涵体沉淀。

2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。

13000rpm离心10min收集沉淀。

3•用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10mi n。

取上清。

4. 将上清稀释至0.1-1.0mg/ml,装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4C缓慢透析24-36h。

最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。

5. 对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。

附注：
①EDTA防止蛋白降解
②NaCI —定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力
③Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒 DNA和其他杂质
④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白
⑤&巯基乙醇/DTT作为还原剂打开错配的二硫键
⑥脱氧胆酸钠作为离子型去垢剂能促溶蛋白
⑦⑧甘氨酸、甘油促溶
⑨PEG可逆修饰折叠中间体的疏水基团
⑩氧化型和还原型谷胱甘肽促进二硫键的形成。

(11)1g 菌使用 35mI 液体重悬即可。