对α-淀粉酶的系统性研究时有财，朱习爱，谭顺耀，李兴周（云南大学 生命科学学院生命科学系 云南 昆明 650500）摘要：α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。
α-淀粉酶作用淀粉时可从分子内部切开α-1,4糖苷键，而生成小分子糊精和还原糖，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称为α-淀粉酶。
本文通过一系列实验，对α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性测定等七个方面的内容进行系统的研究，进一步加深了对该酶性质方面的理解，提高了实际操作能力。
关键词：α-淀粉酶，酶活力测定，发酵培养，酶提取，分离纯化一、 α-淀粉酶酶活力测定 1.1碘比色法1.1.1原理：酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。
反应式：淀粉→红色糊精。
淀粉及糊精检测原理：碘检测淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）1.1.2材料：碘原液，比色稀碘液，标准比色碘液，pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，2%可溶淀粉溶液，标准糊精溶液，标准终点色溶液，蒸馏水，相关玻璃仪器（试管、移液管、滴管）等。
1.1.3 方法：发酵液（酶液） 2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液预热60℃）混匀、计时（保温60℃），反应开始在白瓷板上定时取样（1滴）比色比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）代入公式计算酶活力单位1mL 标准糊精液＋混匀标准比色管（红棕色）对照比色确定反应终点1.1.4 计算公式)/(485.0%22060mL tNN t μ=÷⨯⨯⨯=酶活力单位ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成 Ｎ——为酶的稀释倍数（控制反应时间） 1.2 DNS 法 1.2.1原理：淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
1.2.2材料：3，5-二硝基水杨酸氢氧化钠；酒石酸钾钠；重蒸苯酚；无水亚硫酸钠，标准麦芽糖溶液，0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液，1%马铃薯淀粉溶液，麦芽糖，蒸馏水，相关玻璃仪器等。
1.2.3标准曲线的制作 相关试剂加入表： 试 剂 管 号1 2 3 4 5 6标准麦芽糖溶液 （m L ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水（m L ） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0麦芽糖含量 （m g ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 D N S 试剂（m L ）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0加入完成混匀后沸水浴5min ，定容至25mL 混匀比色。
1.2.4 酶活力测定步骤（流程）1.2.5计算公式N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min1.3实验结果分析将实验数据带入excel得到标准曲线方程：Y=0.545X-0.029由方程和上式可计算出α-淀粉酶酶活力为500（u/ml）蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×NA280=0.4 A260=0.42代入上式得蛋白质含量为27（mg/ml）比酶活力为18.52（u/ml）.二、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化检测2.1 基本原理分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）；分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落；检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断；同时可以结合糊化淀粉冷藏后变性透明度降低，淀粉酶扩散水解淀粉也会产透明圈。
2.2材料马铃薯浸液，玉米淀粉，琼脂，可溶性淀粉，Na2HPO4 .12H2O，（NH4）2SO4 ，NH4Cl，豆粕粉浸出液，培养基，无菌吸管，无菌水，涂布器，CaCO3等。
2.3本次实验基本流程2.4.1样品平板菌落计数结果（表一）1 0.5 0.3 1.67 72 0.4 0.1 4 1 30.350.152.335细菌总数 培养皿号 123平均123平均123平均 123平均 菌落数 无法计数 无法计数 59617565567523CFU/g 3.25*108菌落数培养皿号 123平均 123平均 123平均 123平均 菌落数 02132CFU/g 1*108 产淀粉比例30.7%4 0.3 0.2 1.5 85 0.3 0.15 2 66 0.4 0.3 1.33 97 0.25 0.1 2.5 48 0.2 0.1 2 69 1.5 0.6 2.5 410 1.4 0.6 2.33 511 1.38 0.5 2.76 212 1.32 0.5 2.64 3 2.5 分析从样品平板菌落计数结果和点接平板培养后碘液显色反应结果可以看出，样品平板菌落在稀释度为10-4,10-5时，菌落数较密集，可能由于操作上的问题或菌落本身及培养条件不同，产淀粉酶菌株占总菌数的4.0%，比例较低，根据表二可知，菌株3和5的D/d比值最大，可知其产酶量最大。
三、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定3.1 基本原理摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的，浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）.根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基.细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的营养物质，细胞代谢活性较高。
3.2 实验基本流程3.4结果记录分析3.4.1初筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表（表三）菌株编号反应时间稀释倍数酶活力单位（u/ml ）分秒分钟 1 7307.5 10 64 2 6 35 6.58 10 72.94 3 7 0 7 10 68.57 480 810 603.4.2复筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表（表四）重复瓶号反应时间 稀释倍数酶活力单位（u/um ）分秒 分钟 1 7 30 7.5 10 64 2 6 30 6.5 10 73.85 3700710 68.57准备发酵培养基 灭菌冷却后接种环接种（1瓶/株）恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤 测定酶活力确定1-2株复发酵菌株灭菌一级液体活化菌种液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株） 准备发酵培养基恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤测定酶活力灭菌4 7 30 7.5 10 64 平均7.1251067.373.5 分析在初筛的时候，目的是找出酶活力最强的菌株编号，所以当每一瓶的反应时间超过最短反应时间后我们就没有再继续测了，所以1、2、3号菌株为了节省时间就没有测得最终反应时间。
由表三可以看出，1、2、3、4号菌株中酶活力最强的为2号菌株，但是在相同条件下与其他组相比，酶活还是较低。
通过表四可以看出，复筛用的是酶活力最大的菌株，通过摇瓶培养，酶活力进一步提高，酶活力最高的为第二瓶。
经过本次试验，是我们了解了利用微生物摇瓶发酵培养有了一个全面的认识，对实际生产有重要的指导意义。
同时，实验耗时较长，需要足够的耐心才行。
四、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验 4.1基本原理利用正交试验所选试验的“均匀分散，齐整可比”特点，通过其中对部分试验结果的分析，从而达到了解全面试验的情况，最终完成用部分试验来代替全面试验的目的和结果。
4.2 实验基本流程酶活力高的发酵液合并离心（12000转/分钟，10分钟测定发酵液酶活力-20℃冷冻保存收集上清液 用时提前水浴溶化 量取250m L 放入1 加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇（500m L ）混匀后冷冻离心（4000转/分钟，10分钟）去上清乙醇混合液（统一收集）冷冻离心（4000转/分钟，10分钟）再加入100m L-20℃预冷无水乙醇脱水处理 轻摇后去上清乙醇液（统一收集）沉淀室温真空干燥（备用）4.4结果记录分析4.4.1直观分析表4.5 分析正交优化实验无论在发酵工业中，还是在科学研究中都有广泛用途，虽然在3个周之内不可能让我们完全掌握有关知识，但是本实验让我们了解了优秀菌株的筛选流程，提高了我们的实际操作能力，掌握了正交实验的基本方法和步骤，涉及因素，但存在不足的一点就是数据分析软件不会用，这点需要我们大大提高。
五、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化及相关生物学特征的测定5.1相关材料样品管，离心管，胶头滴管，试剂瓶，层析装置，缓冲液，氢氧化钠，氯化钙，氯化钠，相关玻璃仪器等。
5.2 基本原理5.2.1 α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化采取相应方法和措施，降低酶蛋白在水中的溶解度，从而使其沉淀出来。
分离沉淀（离心、过滤等），并快速脱水干燥。
根据生物酶存在的位置，采取的方法步骤也有所不同。
①胞外酶——前期去除不溶杂质。
②胞内酶——需要增加破壁、浸提（溶解）、浓缩等步骤（步骤较多）5.3 操作步骤 5.3.1粗酶提取5.3.2离子交换层析酶活力高的发酵液合并离心（12000转/分钟，10分钟测定发酵液酶活力-20℃冷冻保存收集上清液用时提前水浴溶化 量取250m L 放入1 加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇（500m L ）混匀后冷冻离心（4000转/分钟，10分钟）去上清乙醇混合液（统一收集）冷冻离心（4000转/分钟，10分钟）再加入100m L-20℃预冷无水乙醇脱水处理轻摇后去上清乙醇液（统一收集）沉淀室温真空干燥（备用）0.5m o l /L N a O H 再生 蒸馏水水洗 缓冲液平衡柱子准备梯度洗脱液启动电脑色谱软件，熟悉软件1.2m L /m L 流速上样12m i n更换缓冲液进液10m i n连接梯度洗脱器 （注意排管道内空气）调节泵速至0.6m L /m i n ，开泵提前打开所有仪器设备电源，并进行预调节，熟悉仪器 调节紫外检测器后，打开1个新的洗脱色谱图计时3.5分钟后，打开部分收集器装柱平衡调整 测定恒流泵的流速并调整至1.2m L /m i n分别加入梯度洗脱仪中（左高右低）设置分部收集器（10管/10m i n ）等待10分钟，分部收集器正常转动1管后，离开12小时以后观察结果，并进行后继检测停泵5.3.3最适PH 值的测定准备稀释好的酶液（DNS 法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5）先配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 2倍浓度磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液；用蒸馏水配制2%马铃薯淀粉溶液（121.3℃，20min 处理充分溶解）； 5.4 结果记录纯化过程发酵液（酶）体积（mL ）或酶粉的质量（g ）所取样品量 （mL 或g ）取样量所占样品总量的比例所测样品酶活力单位 （U/mL或U/g ） 所测样品蛋白质含量 （mg/mL或mg/g ）总酶活力（U ）总蛋白（mg ）比酶活力 （U·mg -1）回收率 （%）纯化倍数5.4.1离子交换层析结果 5.4..2 蛋白含量测定计算麦芽糖含量。