• 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可 以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以 是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).
• 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯 度.
• 引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板 DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp, 上下游引物
解链; • (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度
(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配 • (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA
的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.
• 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循 环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环 就可使DNA扩增达数百倍。
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。
• 引物: oligo dT, random primer等。 • RNA酶抑制剂 • 底物：等浓度的四种dNTP • 反应环境: 缓冲液（RT buffer）
逆转录酶
定义： 是RNA指导的DNA聚合酶。
具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 DNA指导的DNA聚合酶 RNase H的活性
可单独购买或逆转录试剂盒
逆转录反应（cDNA合成）
• 逆转录（reverse transcription）： 是 指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成 DNA的过程。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N双 A 链
单 链 DNA
逆转录反应体系的基本成分
• 模板: 组织或培养细胞总RNA。
• 逆转录酶：AMV: 禽类成髓细胞性白血病病毒 M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒
• 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
• 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不 要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于 水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行 mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
R 模 板 NA
DNA-杂 R化 N 双 A 链
单 链 DNA
Байду номын сангаас
引物
• Oligo dT ：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA 、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT 要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即 使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
避免RNA酶污染
• 由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加 上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中 要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这 是本实验成败的关键。
• 在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转录过 程中都要避免RNA酶污染。
• DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。实验用 品用0.1%DEPC水处理，高压蒸汽灭菌后烤干备用 或购买经过处理的无RNA酶实验用品。
常用实验基本技术
四大常用基本技术
• 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） • 免疫组织化学技术（免疫组化） • 免疫印迹技术（Western blot）
• 细胞培养技术
常用分子生物学技术
• RNA的提取和cDNA合成 • 聚合酶链式反应(PCR)扩增和产物克隆 • 重组质粒的连接、转化及筛选 • 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 • 测序技术 • DNA酶切及凝胶电泳
逆转录酶
• 在逆转录酶的作用下，总RNA中的mRNA在体外被反向转 录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模 板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；
• 利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核 苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量 的cDNA或目的片段
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
局限性 联合应用
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
• 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA 、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模 板的RT-PCR反应。
• 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已 知的情况。
cDNA合成最常用的引物是与真核细胞 mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸 长的oligo(dT)。