基于适配体的石墨烯修饰玻碳电极检测卡那霉素游元丁;田亚平;周楠迪【摘要】建立了一种基于适配体和石墨烯修饰玻碳电极检测卡那霉素的方法.卡那霉素适配体(Kana-aptamer)可以吸附在石墨烯(Gr)修饰的电极表面,从而阻碍电化学探针[Fe(CN)6]3-/4-与电极表面的电子传递,然而与含有卡那霉素的样品反应后,卡那霉素能与适配体结合并使其从电极上置换脱落,对界面电子传递的阻碍作用降低,探针的电化学信号得到恢复.通过循环伏安法和原子力显微镜法对该过程进行了表征.该原理被用于对卡那霉素进行电化学检测,结果表明:在优化条件下,用差分脉冲伏安法(DPV)检测卡那霉素时,其线性范围为1 ×10-6～1 ×10-5 mol/L,检出限为5×10-7 mol/L.该方法应用于牛奶样品中卡那霉素的检测,结果满意.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2015(034)005【总页数】5页(P600-604)【关键词】卡那霉素;适配体;石墨烯;玻碳电极【作者】游元丁;田亚平;周楠迪【作者单位】江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】O657.1;R978.1基于适配体的石墨烯修饰玻碳电极检测卡那霉素游元丁，田亚平，周楠迪*(江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘要:建立了一种基于适配体和石墨烯修饰玻碳电极检测卡那霉素的方法。
卡那霉素适配体(Kanaaptamer)可以吸附在石墨烯(Gr)修饰的电极表面，从而阻碍电化学探针［Fe(CN)6］3-/4-与电极表面的电子传递，然而与含有卡那霉素的样品反应后，卡那霉素能与适配体结合并使其从电极上置换脱落，对界面电子传递的阻碍作用降低，探针的电化学信号得到恢复。
通过循环伏安法和原子力显微镜法对该过程进行了表征。
该原理被用于对卡那霉素进行电化学检测，结果表明:在优化条件下，用差分脉冲伏安法(DPV)检测卡那霉素时，其线性范围为1×10-6～1×10-5mol/L，检出限为5×10-7mol/L。
该方法应用于牛奶样品中卡那霉素的检测，结果满意。
关键词:卡那霉素;适配体;石墨烯;玻碳电极中图分类号:O657.1; R978.1 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2015)05-0600-05doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.05.017收稿日期:2014-11-14;修回日期:2014-12-28基金项目:国家自然科学基金项目(31271860);教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-12-0878)*通讯作者:周楠迪，博士，副教授，研究方向:生物分析与检测技术，Tel:0510-********，E-mail:**********************.cnAptamer-based Detection of Kanamycin Using Graphene Modified Glassy Carbon ElectrodeYOU Yuan-ding，TIAN Ya-ping，ZHOU Nan-di*(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)Abstract:A method of aptamer-based detection of kanamycin was established by using a graphene modified glassy carbonelectrode.Kanamycin-specific aptamer(Kana-aptamer) could be adsorbed onto the graphene(Gr) modified electrode，which prevents the electron transfer between the probe ［Fe(CN)6］3-/4-and the electrode.However，after incubation with samples containing kanamycin，kanamycin could bind with aptamer and replace it from the electrode，which in turn declines the resistance of the electron transfer and recovers the electrochemical signal.The procedure was firstly characterized by cyclic voltametry(CV) and atomic force microscopy.Then this replacement effect was utilized to electrochemically determine kanamycin.Under the optimized conditions，kanamycin could be determined by differential pulse voltammetry(DPV)，and the calibration curve was linear in the ran ge of 1×10-6-1×10-5mol/L，with a detection limit of 5×10-7mol/L.The method was successfully applied in the detection of kanamycin in milk samples with satisfactory result.Key words:kanamycin; aptamer; graphene; glassy carbon electrode卡那霉素(Kanamycin)是一种氨基糖苷类抗生素，具有水溶性好、抗菌谱广等特点，主要对革兰阴性菌(如大肠埃希菌、变形杆菌属、肺炎杆菌等)引起的严重感染有疗效，是我国农业、畜牧业、水产业中常用兽药之一。
过量或不合理的使用使卡那霉素残留在动物源性食品中。
卡那霉素的长期使用会导致耳毒性、肾毒性等毒副作用，对神经肌肉接头产生阻滞作用，引起过敏反应等［1-5］。
为保护人体健康，许多国家对卡那霉素在食品(如牛奶、蜂蜜等)中的最大残留浓度作了规定。
目前，卡那霉素的检测方法主要有高效液相色谱法［6］、荧光法［7-8］、电化学法［9-10］、酶联免疫测定法［11-12］等。
这些方法多需要大型仪器，耗时较长，并且对样品预处理有比较严格的要求，限制了其在食品分析中的应用。
因此，建立快速有效的检测食品样品中卡那霉素含量的方法具有重要意义。
适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的一段单链DNA或RNA分子，能与低分子量的有机物、无机物或大分子(如蛋白质)等特异结合［13］。
由于其与靶标分子的结合具有高亲和性、高特异性，加之易于制备、修饰、相对稳定等特点而被广泛应用于蛋白质、抗生素、金属离子的检测［14-16］。
石墨烯(Gr)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状结构的新型碳材料，因其具有电子传递效应良好、机械强度高、比表面积较大等特点被广泛应用于电化学检测［17-21］。
本研究将石墨烯修饰于玻碳电极(GCE)表面，石墨烯通过π-π堆积作用将卡那霉素特异性适配体(Kanaaptamer)吸附在电极表面，利用卡那霉素能将Kana-aptamer从石墨烯上竞争下来，从而以［Fe (CN)6］3-/4-作为电化学探针，采用差分脉冲伏安法(DPV)实现对卡那霉素的检测。
1 实验部分1.1 仪器与试剂CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司)，超纯水机(上海涞科实业发展有限公司)，冷冻离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)，CQ25-12型超声波清洗机(上海新芝生物技术研究所)，Delta320酸度计(梅特勒-托利多公司)，安捷伦5500原子力显微镜(Santa Clara，CA，USA)。
石墨烯分散液(Gr，苏州诺德派森医药科技有限公司);卡那霉素溶液:硫酸卡那霉素(上海生工生物工程股份有限公司)溶于1 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0);铁氰化钾、亚铁氰化钾、氯化钾、三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);电解液:含有5 mmol/L K3［Fe(CN)6］，5 mmol/L K4［Fe(CN)6］，0.1 mol/L KCl的10 mmol/L PBS(pH 7.4);伊利全脂灭菌纯牛乳(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)。
实验所用的卡那霉素适配体(Kana-aptamer:5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3')［22］由上海生工生物工程股份有限公司合成;玻碳电极(4 mm，武汉高仕睿联科技有限公司);铂电极、Ag/AgCl电极均购自上海辰华仪器有限公司，实验用水为超纯水。
1.2 玻碳电极的修饰玻碳电极(GCE)修饰之前，先将电极置于5 000目的细砂纸上打磨，然后在抛光绒布上依次用0.5，0.05 μm的Al2O3抛光粉打磨5 min，水冲洗，直至电极表面无划痕，光滑呈镜面。
然后将玻碳电极分别置于水、无水乙醇、水中超声清洗15 s，氮气吹干，即得到表面处理干净的玻碳电极。
将石墨烯分散液用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)稀释至0.5 mg/mL，取5 μL滴加于玻碳电极表面，晾干即得石墨烯修饰的玻碳电极(Gr-GCE)。
在Gr-GCE上滴加10 μL Kana-aptamer，晾干，用水冲洗1 min，将未牢固吸附在Gr-GCE上的适配体冲洗下来，自然晾干，得到适配体-石墨烯修饰的玻碳电极(Ap-Gr-GCE)。
同样的方法在清洗好的玻碳电极上直接滴加10 μL Kana-aptamer 得到适配体修饰的玻碳电极(Ap-GCE)，用作对照实验。
1.3 电化学检测取20 μL含有不同浓度卡那霉素的样品与构建好的Ap-Gr-GCE孵育反应一段时间。
待孵育结束后，用水冲洗电极表面。