Membrane
Electrode 2
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电穿孔法
生 物 化 学 第九章 糖代谢
DNA Movement
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__Leabharlann ____
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+ +
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电转仪
生 物 化 学 第九章 糖代谢
基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物 学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基 因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂 种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有 的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。
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生 物 化 学 第九章 糖代谢
细胞工程
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重组DNA导入受体细胞 重组体导入哺乳动物细胞
脂质体介导法：人工细胞膜（培养细胞） 病毒感染法（腺病毒） 显微注射法（转基因） 磷酸钙共沉淀法
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三、 DNA重组体的筛选与鉴定
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基因工程的发展
1982 世界上第一只转基因动物 --- “巨鼠” 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），
中国水生所转基因鱼 1990 HGP实施 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 2000 人类基因组草图绘制完成
年获诺贝尔医学和生理学奖 。
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基因工程技术的关键
DNA ligase (glue): 1967 Restriction enzyme (scissors): 1970 Genetic engineering vector: 1973
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指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行 拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使 之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性 状的DNA体外操作程序
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基因工程
基因工程即指重组DNA技术的产业化设计与应用， 包括上游技术和下游技术两部分。上游技术是指基 因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技 术）。下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规 模培养以及基因产物的分离纯化过程。
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氯化钙转化法
附着：在1.5ml Eppendorf管中加入100 μl感 受态细胞和<10μl 40ng DNA溶液， 温和混匀， 于冰上50min。
热激：于42℃水浴90S。
冷激：冰浴2min。
复苏：加500μl LB液体培养基37℃ x 50min
分子克隆技术
生 物
酶工程
上游技术 重组DNA技术
工 基因工程
DNA转移技术
程 蛋白质工程 下游技术 工程菌(细胞)克隆表达技术
分离纯化技术
微生物工程
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生物化学
基因工程主要内容 基本工具
第九章 糖代谢
基本操作程序
应用
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基因工程的发展
基因工程的逐渐成熟阶段
1977年，日本科学家首次在大肠杆菌中克 隆并表达了人生长激素释放抑制素基因， 首次实现真核基因的原核表达
随后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中 表达了人胰岛素基因
1978年，美国Genentech公司开发出利用重 组大肠杆菌合成人胰岛素，1982获准使用。
焦点：基因工程产生的杂种生物和基因的扩散问题， 列如：产生的有害微生物和病毒如果逸出的问题、产 生的高等植物的花粉传播问题等等
从1972年到1976年，人们对DNA重组所涉及的载 体和受体系统进行了有效的安全性改造，包括噬 菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重 组和感染寄生缺陷突变株的筛选，建立了一套严 格的DNA重组试验室设计与规范操作
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基因工程技术流程
“木工”兼“泥瓦匠”
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基本概念 限制性内切酶、连接酶、AP、重组酶等 载体 转化/转染 重组/重组子/重组DNA 基因工程
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限制性内切酶发现及应用
阿尔伯(1929 ～ )
H.O. 史密斯(1931～ )
内森斯 (1928 ～ )
瑞士微生物遗传学家 美国分子生物学家、遗传学家 美国微生物遗传学家
1968年阿尔伯首次成功分离出I型限制性内切酶（RE）；1970年史密斯分 离出II型RE；同年内森斯用II型RE首次完成了对基因的切割。他们于1978
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生 物 化 学 第九章 糖代)
存在于转化细胞内由克隆载体所携带的生 物 化 学 第九章 抗生素的琼 脂糖平皿，37℃培养过夜，观察结果。
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电穿孔法
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No Voltage
Medium (conductivity = )
+
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+
+ +
+ +
+
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+
+
Electrode 1
Membrane
+ +
+
+
Electrode 2
重组DNA(recombinant DNA)
重组：染色体内或间进行片断交换的现象
对不同生物的DNA，在体外用工具酶，进行“剪 切”、“组合”、“拼接”，使DNA按照我们的意 愿重新组合。然后通过运载物质（质粒、噬菌体、 病毒等统称载体）转入微生物、动、植物宿主细胞 内，进行无性繁殖，使我们需要的基因在细胞中表 达，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型
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基因工程技术
Gene engineering technique
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主要内容
概述 工具酶 载体 目的片断的制备 目的片断与载体的重组 重组子导入宿主细胞 阳性克隆的筛选及鉴定 克隆基因的表达 基因工程技术的应用
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转基因动物
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基因工程的操作流程 分：目的基因和载体的获得
切：目的基因和载体的限制性酶切
连：目的基因和载体的连接(体外重组) 转：连接产物(重组体)导入宿主细胞 筛：重组体的扩增、筛选
指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程， 有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和 获得细胞DNA的过程。
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重组DNA导入受体细胞 重组体导入大肠杆菌
氯化钙法 电穿孔法(electroporation) 病毒感染法/体外包装法
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重组DNA导入受体细胞
感染(infection) :
以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重 组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的 病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在 细胞内扩增。
转导(transduction) :
达0.4-0.5 收集：菌液于冰水中摇10min，转入50ml离心管， 4℃, 4000rpm X
10min 洗涤：菌块加30ml冰预冷的 0. 1M CaCl2，置冰上10min，离心洗涤 分装：菌块加入适量的0.1M CaCl2悬浮细胞，100ul/1.5EP分装冻存
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1973年为基因工程元年
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生物化学
Cohen等进行 DNA体外重组实验
第九章 糖代谢
Tcr
Psc101 ECORI
Tcr
连 接
酶
Ner Sr
R6-3 ECORI
N
r e
Sr
PSC101：抗药质粒 R6-3：抗药质粒 Ner：抗新霉素基因
Sr ：抗黄胺基因 Tcr： 抗四环素基因
转化E.coli
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重组DNA技术的开拓
P.伯格(1926～ ) 美国生物化学家
Boyer and Cohen
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基因工程的发展
基因工程的艰难阶段
关于基因工程的争议：
起因：产物是生物，即具有巨大的理论和实践意义， 又具有非常大的危害性。
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基因工程的诞生 第一个重组DNA分子和重组的生物体