1．称量：准确称取各成分。

蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。

配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。

2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。

配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。

4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。

将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。

5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。

其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。

向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。

否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

三、灭菌和消毒
1．无菌技术：①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

2．消毒方法：①日常生活经常用到的是煮沸消毒法；②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒；④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。

3．灭菌方法：①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

4．比较消毒和灭菌：
5．注意事项：①实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。

灭菌后，通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的水分；②物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸；③在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作；④培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染；⑤接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键；⑥接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面，水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。