实验二：酶活力测定方法的研究
一．研究背景及目的
酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。

酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。

酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。

本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。

二．实验原理
萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α淀粉酶和β淀粉酶，β淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化[1]。

本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性[1]。

酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。

然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性，再做进一步分析。

实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。

三．材料、试剂与仪器
材料：
萌发的小麦种子
试剂：
①1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）；
②pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）
B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml 混匀即可；
③3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M 氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）；
④麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml 容量瓶中定容）；
⑤0.4M NaOH
仪器：
722光栅分光光度计(编号990695)
DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056)
离心机(TDL-40B) 配平天平药物天平电热锅
100ml容量瓶50ml容量瓶移液管试管研钵烧杯洗瓶
四．实验方法
本实验按照下列表格的中的操作步骤进行：
五．数据整理
上表中前4行数据为实验的原始数据。

以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），根据标准曲线的方程，计算上表中第4行数据（各样品的OD值）所对应的麦芽糖浓度，填入上第5行中，计算两组平行实验所测麦芽糖浓度的平均值，填入最后一行，如上表。

六．结果计算与讨论分析
根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：
α淀粉酶活性=（A－A’）×样品总体积÷（样品重×5）
(α+β)淀粉酶活性=（B－B’）样品总体积÷（样品重×5）
其中A为α淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度，A’为α淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度，B为(α+β)淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度，B’为(α+β)淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度（以两组平行实验数据的平均值计算）
计算结果如下：
α淀粉酶活性=10.9（毫克麦芽糖•克-1鲜重•分钟-1）
(α+β)淀粉酶活性=236（毫克麦芽糖•克-1鲜重•分钟-1）
(α+β)淀粉酶活性与α淀粉酶活性的差值为225（毫克麦芽糖•克-1鲜重•分钟-1），暂且看作β淀粉酶活性来分析问题。

由以上的结果可以看出：测得的β淀粉酶活性远远高于α淀粉酶活性。

根据实验的可操作性，我们有理由相信α淀粉酶活性的测量值是可信的，但是对于β淀粉酶活性，我们不得不提出这样一些疑问：同是小麦发芽种子中的淀粉酶，活性为何存在如此大的差异？β淀粉酶活性的测量值可信吗？α淀粉酶和β淀粉酶共同的催化能力会等同于它们各自崔化能力的算数和吗？带着这些问题，我查阅了相关文献，结果没有找到关于α淀粉酶与β淀粉酶相互关系的文献，但是发现：在前人的研究中，已经广泛运用了通过α淀粉酶和β淀粉酶总活性与α淀粉酶活性的测定间接得到β淀粉酶活性的方法[3]，而且在一些类似的实验中测定的
结果也是β淀粉酶活性远远高于α淀粉酶活性[2]。

但是这一测定β淀粉酶活性方法的科学性仍然值得怀疑，因为β淀粉酶与α淀粉酶的催化特性是有差异的。

β淀粉酶主要作用于直链淀粉，作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了；而α淀粉酶则无差别地作用于直链淀粉与支链淀粉[4]。

所以我提出设想：β淀粉酶单独作用时催化能力要大打折扣。

不过值得注意的是：本次实验中所用淀粉的结构尚不明确。

七．结论与展望
根据上面结果与分析，作出如下总结：对于酶活性的测定，通过测定一定时间内一定量的酶催化所得产物的量来表征酶的活性不管在逻辑上还是可操作性上都是可行的。

但是通过测定两种酶共同作用时的总活性及其中一种酶的活性从而间接得到另一种酶的活性的方法是值得质疑的，当然我们可以参考前人的实验经验，但是质疑是不可少的。

本实验中运用的通过α淀粉酶和β淀粉酶总活性与α淀粉酶活性的测定间接得到β淀粉酶活性的方法当然也是值得质疑的，至少仅仅通过本实验是不能消除这样的质疑的；但是查阅文献后发现该方法被广泛运用，所以其合理性应该是得到前人证明的，但尚未查到相关的文献，有待进一步的考证。

八．思考题
1．α-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40℃温浴的酶促反应中就能保证β-淀粉酶不会再参与催化反应。

由于β-淀粉酶不耐热，在70℃下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，α-淀粉酶活性也会受到影响；时间不足，β-淀粉酶钝化不完全。

保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变β-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40℃温浴的酶促反应中β-淀粉酶不会再参与催化反应。

此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。

2．酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0℃以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。

在最适反应温度下，酶的催化活性最大，此时的酶与底物的结合性最强；而在最适保存温度下，酶的稳定性最好，此时的酶一般处于失活状态。

这是完全不同的两个状态，所以温度不同是可以理解的。

3．为什么3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？
根据化学反应动力学的原理，高浓度下的反应更完全，为了测定结果的准确，所以当然希望还原糖尽可能完全地参加反应；但是比色法允许测定的浓度是较低的。

3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应在高温下进行，所以先沸水浴使还原糖最大程度地反应再稀释测定能够准确测得所含还原糖的浓度。

4. 在体外进行别构酶活性调控的实验中，有时可以用低浓度的竞争性抑制剂作为酶的别构激活剂使用，其理论基础是什麽？
竞争性抑制剂与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性，能与别构酶的别够中心结合，从而改变酶分子的构象，增强酶的活性，成为酶的别构激活剂。

5. 在酶的分离纯化过程中通常会丢失一些活力，但有时亦可能在某一纯化步骤中酶活力的得率超过100%，产生这种活力增高的可能原因会是什麽？这种情况说明什麽？
由于酶的特性之一就是活性易受到其他物质的影响，如产物、底物或者是样品中的其他杂质，都可能影响着酶的活性。

在酶的分离纯化过程中，随着杂质的减少，影响酶活性的物质随之越来越少，之前存在的抑制酶活性的物质很可能在某一纯化过程中被除去，所以出现酶活的得率超过100%的情况。

这种情况说明酶的活性是很容易受到外界因素的影响的，所以在测定酶的活性时应该加以注意。

6. 有多种方法可区分高分子量的DNA与RNA分子，请写出一种最简便易行的生化分析方法，并说明理由。

通过DNA酶处理待测样品，能够溶于酶液中的是DNA不能溶解的是RNA；或者通过RNA酶处理待测样品，能够溶于酶液的是RNA而不能溶解的是DNA。

原因是酶具有专一性，DNA酶只能水解DNA而不能水解RNA而RNA酶恰好相反。

九．参考文献
[1]生物化学实验指导7-16 中国农业大学生物化学实验室
中国农业大学自编教材
[2]艾志录等不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究
中国粮油学报2006年6月第21卷第3期
[3]马永强等玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究食品科学294~297，
2007, V ol. 28, No. 11
[4]百度百科。