实时定量PCR方法检测转基因产品马荣群1　陈红运2　黄文胜2　朱水芳2(1.西北农林科技大学　杨陵　712100　2.国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所)摘要　实时定量PCR方法检测转基因产品,操作简单,省时省力,结果可靠、准确性高。

该方法利用特异性荧光探针实时监测目的基因的扩增,同时循环参数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。

利用阳性标准样品的Ct值,制成标准曲线,再根据未知样品的Ct值就可以准确确定起始DNA的数量。

高纯度探针和适宜的镁离子浓度是该方法准确定量的关键。

实时定量PCR方法有效地解决了其他定量方法所存在的假阳性及定量准确度不高的难题。

关键词　实时定量PCR　荧光探针　转基因检测 随着现代分子生物学技术的飞速发展,转基因产品(GMO)日益走进人们的生活。

自从1983年转基因技术成功地应用于植物以来,全世界转基因农作物的种植面积迅速扩大,其中以美国、加拿大、阿根廷、澳大利亚等国种植面积较广。

转基因作物种类主要有大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、番茄等,其表型主要包括抗虫、抗病毒以及抗除草剂等。

理论上,只要知道任何生物的核酸序列,就可以进行转基因操作,因此,转基因技术应用的潜力是巨大的。

然而,转基因产品的安全性以及转基因生物对人类健康的生态环境的影响引起了世界各国的普遍关注。

欧盟、日本、韩国和俄罗斯等国已开始对转基因食品实行标签制度,要求进口农产品注明转基因产品的种类和含量。

中国加入世贸组织后,随着关税的降低和农产品市场的开放,国外的农产品必将以其优良的品质和低廉的价格大量涌入,而我国进口的粮食、大豆、食用油等大部分来自美国、加拿大等转基因技术发达、转基因农作物栽培面积较大的国家。

因此,建立快速、简便、准确的转基因检测方法非常必要。

实时荧光定量PCR是新近出现的一种定量检测方法,PCR扩增后采用荧光显示,算法更为精确[1,2]。

1　几种传统定量PCR方法简介[3]1.1　内参照法在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记,下游引物不标记。

在模板扩增的同时,内标也被扩增。

在PCR产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照对待检测模板进行定量。

1.2　竞争法选择由突变克隆产生的含有一个新内切酶位点的外源竞争性模板。

在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增(其中一个引物为荧光标记)。

扩增后用内切酶消化PCR产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被切割,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数[4,5]。

1.3　PCR-EL ISA法利用地高辛或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗地高辛或生物素酶标抗体—辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。

常规的PCR -EL ISA法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的[6]。

2　定量所用参照物PCR技术应用于核酸的定量检测早有报道,但技术上的不成熟阻碍了其广泛应用。

PCR在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物[7,8,9]。

参照物在定量PCR中具有以下作用:a.作为扩增系统的阳性对照;b.作为未知样本定量的参比标准;c.通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率,使其具有可比性。

参照物按其性质不同可分为内参照(内标)和外参照(外标)。

由于传统定量方法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差,无法直接从终点产物量推算出起始模板量。

加入内参照后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。

但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。

也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。

美国得克萨斯大学的科研人员对外标法定量和内标法定量进行了比较,认为将内标法作为定量或半定量的手段不可靠,而外标准曲线的定量方法是准确的、值得依赖的方法[10]。

3　实时荧光定量PCR技术上述几种传统定量PCR方法,一直面临着两大难题,PCR的假阳性污染和定量的准确度。

用这些方法进行检测,都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程,而这些处理过程很易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中,使PCR假阳性污染成为可能,尤其是电泳所用染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质,若操作不当,会严重危害操作者的健康。

另一方面,所有这些方法的定量都是针对PCR终产物来进行的,而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性,使定量准确度难以提高[7,8]。

与这些传统方法不同,实时定量PCR方法采用完全闭管检测,不需PCR后处理,避免了交叉污染;采用实时监测技术,定量PCR仪采用激光器光源,保证高能稳定无干扰的荧光激发,由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成的光学系统将激发荧光聚焦到光谱仪上,光谱仪以间隔的方式将荧光按照波长的不同分开,进入CCD相机,序列检测应用软件从CCD相机中收集这些荧光信号,对数据进行分析。

从检测开始到定量结束,整个过程耗时短,操作方便。

这种方法采用一个双标记荧光探针来检测PCR产物的积累,可非常精确、重复地定量基因拷贝数,并且比一般的定量方法劳动强度小[1,2]。

3.1　实时荧光定量PCR原理[1,2]实时荧光定量PCR技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。

实时定量PCR技术是在常规PCR基础上,添加了一条标记了两个荧光基团的探针。

一个标记在探针的5′端,称为荧光报告基团(R);另一个标记在探针的3′端,称为荧光抑制基团(Q)。

两者可构成能量传递结构,即5′端荧光基团所发出的荧光可被荧光抑制基团吸收或抑制。

当二者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强。

荧光信号随着PCR产物的增加而增强。

实时定量PCR方法就是利用此原理,在PCR过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。

当信号增强到某一阈值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,此时的循环次数(Ct值)就被记录下来。

该循环参数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。

利用阳性梯度标准品的Ct值,制成标准曲线,再根据样品的Ct值就可以准确确定起始DNA的数量。

3.2　实时荧光定量PCR所用荧光探针目前应用于实时定量PCR检测体系中的荧光探针主要有两种:一种是TaqMan探针[10],一种是分子信标探针[11～12]。

Tyagi 和Krammer(1996)首次建立了分子信标探针,在同一寡核苷酸探针的5′端标记荧光素、3′端标记淬灭剂(DABCY L)。

分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA 无关的碱基互补的臂。

无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂, DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。

当探针遇到目的DNA分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,使两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。

影响分子信标探针构型变化的参数主要有:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4-12个核苷酸可形成稳定的杂交茎。

噜扑环长度至少应是臂长的2倍,才能保证探针与目标DNA杂交及荧光素与淬灭剂分开。

TaqMan探针是一段5′端标记报告荧光基团,3′端标记淬灭荧光基团的寡核苷酸。

报告荧光基因如FAM共价结合到寡核苷酸的5′端。

TET、V IC、J OE及HEX也常用作报告荧光基团。

所有这些报告荧光基团通常都由位于3′端的TAMRA所淬灭。

当探针完整时,由于报告基团与淬灭基团在位置上很接近,导致其报告荧光的发射主要由于Forster型能量传递而受到抑制[13]。

在PCR 过程中,上游和下游引物与目标DNA的特定序列结合,TaqMan探针则与PCR产物相结合。

TaqDNA聚合酶的5′-3′外切活性将TaqMan探针水解。

而报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开,导致报告荧光信号的增加。

T aqMan探针的3′端则经过化学修饰,以防止其在PCR过程中被延伸。

探针与产物的结合发生于PCR的每一循环,但并不影响PCR产物的指数积累。

报告荧光基团与淬灭荧光基团的分离导致报告荧光信号的增加,而荧光信号的增加可被系统检测到,它是模板被PCR扩增的直接标志。

引物和探针都必须与模板结合(杂交),才能实现PCR扩增和探针的水解;与探针特异结合的DNA模板得到扩增时才能产生荧光信号。

基于这两点要求,即使发生非特异性扩增,也不会影响检测结果。

荧光定量检测的主要影响因素在于所用探针的纯度以及镁离子浓度,二者在很大程度上决定了检测结果的真实性和可靠性。

探针的纯度直接影响探针荧光本底的高低。

任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源,未淬灭的报告荧光使探针的荧光本底增高,导致难以辨认由于探针裂解而产生的报告荧光的变化。

同时由于探针标记不完全,即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二者均未标记上,这样,即使荧光探针与扩增产物结合,也不能检测到荧光信号的增长,很容易造成假阴性。

另外,镁离子浓度的高低也直接影响了检测的灵敏度。

4　实时定量PCR技术应用于转基因产品检测对转基因产品进行定量检测,国外已有文献,国内尚未见相关报道。

转基因产品的检测可以从核酸和蛋白质水平上进行检测[12]。

定量检测主要是基于核酸水平的检测,由于目前转基因技术中使用的基因构件主要来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S 启动子和农杆菌的NOS终止子,绝大部分转基因产品含有这两个基因片段,所以检测35S启动子和NOS终止子基本可达到检测转基因产品的目的。

但由于35S来源于花椰菜花叶病毒,十字花科的植物(如油菜)易自然感染CaMV,如果对进口转基因油菜针对35S设计引物进行检测,则可能将感染CaMV的非转基因油菜判定为转基因产品,从而引起贸易纠纷。

鉴于此,对这类产品应进行目的基因检测。